三苯基錫和聚苯乙烯微塑料聯合暴露對大鱗副泥鰍的急性毒性效應

王 偉，王亞軍，李立杰，沈子偉，倪朝輝，譚鳳霞，柴 毅

(1.長江大學濕地生態與農業利用教育部工程研究中心，湖北荊州 434025；2.長江大學農學院，湖北荊州 434025；3.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025；4.中國水產科學研究院長江水產研究所，農業農村部長江中上游漁業資源環境科學觀測實驗站，武漢 430223)

三苯基錫(triphenyltin,TPT)是一類重要的有機錫化合物，具有較強的殺菌能力，常被作為農業殺菌劑而被廣泛應用，由于其過量使用導致土壤中濃度較高，并可能通過地表徑流進入水環境，從而造成水域生態環境污染。TPT還可用于船舶的防污涂料，這也是其在水環境中較高濃度的主要原因之一。有研究表明我國水域中TPT的污染狀況已十分嚴重，據報我國廈門近海環境中的TPT濃度為2.2～160 ngSn/L，嘉陵江段水體中的TPT濃度也已高達37.2 ngSn/L，長江流域三峽庫區受到有機錫污染的最大濃度為393.35 ngSn/L。水環境中較高濃度的TPT除了對各種水生生物可能產生直接危害外，還可進一步通過食物鏈被放大，使整個水域生態系統面臨更嚴重的風險。有研究表明，TPT可顯著降低中華鱘的產卵量和產卵率，誘發中華鱘()幼體畸形，是導致中華鱘物種退化的主要原因之一。對斑馬魚()的系列研究表明，TPT暴露可引起其生長抑制、視力衰退、氧化應激和甲狀腺分泌紊亂等不良影響。

國際上將粒徑≤5 mm的塑料顆粒定義為微塑料(microplastics,MPS)，主要是由較大的塑料碎片在生物降解、光降解以及物理磨損等作用下分解產生的，屬于新型污染物，已引起人們極大的關注。由于塑料價格低廉、經久耐用和攜帶方便等優點，被廣泛應用于工農業生產及日常生活中，而造成的塑料廢棄物導致水環境中積累的MPS濃度正在持續增加。有數據表明，沿海港口水域通常是MPS的聚集區域，瑞典港口地區海水中的MPS濃度已達到100 000個/m，在英國添馬艦港口檢測的MPS豐度占全部碎片的65%，在中國長江口地區和三峽庫區也發現了微塑料污染，其豐度分別為(4 137.3±2 461.5) 個/m和1 597～12 611個/m。已有多項研究對MPS的毒性作用機制進行了研究。結果表明，聚苯乙烯微塑料能夠在斑馬魚腮、腸以及肝臟組織中積累，并誘導氧化脅迫，擾亂魚體的脂質和能量代謝，引起炎癥反應。MPS由于其尺寸小，比面積大，吸附能力強，也可成為其他環境污染物的載體并與之相互作用。MPS在聯合毒性實驗中表現出對染毒物質不同的調節作用，如MPS和三苯基錫聯合暴露會延緩胭脂魚()的死亡時間、與銅聯合暴露促進了銅在斑馬魚肝臟和腸道組織中的積累，加重了腸道和肝臟中的毒性，表現為丙二醛(MDA)和金屬硫蛋白(MT)水平升高，超氧化物歧化酶(SOD)水平下降，與菲聯合暴露加劇了斑馬魚氧化應激以及相關抗氧化基因的表達量。因此MPS和環境污染物聯合作用值得關注。

大鱗副泥鰍()是一種小型底層雜食性魚類，適應性強，棲息范圍廣，對化學藥物敏感，易于在實驗室養殖，是較為理想的水生生物實驗材料。目前已有多種水產藥物對大鱗副泥鰍毒性試驗相關研究。本實驗通過研究三苯基錫單獨暴露和與微塑料聯合暴露對大鱗副泥鰍的急性毒性效應，通過半致死濃度(LC)、安全濃度(SC)、藥物蓄積程度系數(MAC)和不同時間段的死亡率來分析三苯基錫對大鱗副泥鰍的毒性變化規律以及聚苯乙烯微球與三苯基錫的聯合毒性效應，為水環境保護及污染治理提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

大鱗副泥鰍由荊州市漁都特種水產養殖公司提供，挑選規格一致[體重(0.097±0.013) g，體長(2.03±0.15) cm]、體質健康的個體進行實驗。實驗開始前暫養一周，暫養水箱長0.7 m，寬0.5 m，暫養水體pH 7.5，溶解氧≥6.5 mg/L，水溫(20±1) ℃，光照周期設置為14 h光照:10 h黑暗。每天正常喂食，日投喂量為1.5%。暫養水每24 h更換。正式實驗開始前24 h停止喂食。

1.2 暴露液配制

將TPT(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶于二甲基亞砜(天津市科密歐化學試劑有限公司)配制成1 g/L的母液，避光4 ℃保存，實驗前再根據濃度設置梯度用蒸餾水稀釋到所需濃度。

聚苯乙烯微球(無錫瑞格生物科技有限責任公司)粒徑為200 nm，密度為1.05 g/cm，變異系數(CV)<6%，乙醇中溶脹率為5%～10%，微球電鏡形貌如圖1所示，實驗前用蒸餾水稀釋到所需濃度。

圖1 聚苯乙烯微球形貌表征Fig.1 Morphology characterization of polystyrene microspheres

1.3 實驗方法

通過預實驗，觀察96 h內大鱗副泥鰍的死亡情況，得出24 h全部死亡的最低濃度和96 h全部不死亡最高濃度。根據預實驗的結果來設置正式實驗TPT的濃度梯度。

1.3.1 TPT急性毒性實驗

根據預實驗結果按等對數間距設置6個濃度梯度(表1)，每濃度組10尾實驗魚，設3個平行組，1個空白對照組。采用半靜態方式水生生物急性毒性實驗法，實驗期間不投喂，為保證實驗暴露液的濃度，每隔24 h更換暴露液一次。實驗開始后12 h連續觀察實驗魚的運動情況并記錄，在24、48、72、96 h觀察死亡情況并及時清出死亡個體。

表1 TPT的濃度梯度Tab.1 The concentration of TPT

1.3.2 TPT和聚苯乙烯聯合毒性實驗

在LC實驗基礎上，每個TPT濃度組與聚苯乙烯微球溶液(1 mg/L)聯合對實驗魚進行96 h急性毒性實驗。每個濃度組設置三個平行，一個空白對照組。

1.4 數據處理

采用寇式法(Karber)計算LC、SC和LC的95%置信區間(CI)，利用MAC來分析實驗魚體內對藥物的蓄積、降減變化。采用檢測比較TPT與TPT+聚苯乙烯處理下實驗魚存活情況是否存在差異，當<0.05時認為差異顯著，<0.01時差異極顯著。相關計算公式如下：

LogLC=-(∑-05)；

SC=48 h LC×0.3/(24 h LC/48 h LC)；

95%CI=LogLC±1.96×[∑(pg/n)]；

MAC=100%×(LC-LC)/(LC-LC)，

公式中:為消毒劑最大濃度的對數，為相鄰濃度的對數差值，為死亡率(%)，∑為各組死亡率之和，為存活率()，為每組實驗魚的尾數，LC和LC為觀察時段和的半致死濃度值(mg/L)，LC和LC分別為實驗初始、結束時半致死濃度(mg/L)。

2 結果

2.1 TPT單獨暴露對大鱗副泥鰍的急性致死效應

實驗開始6 h后，TPT高濃度組(Ⅴ和Ⅵ)實驗魚開始出現明顯應激反應，表現為易受驚擾，急促不安地上下游動，游動迅速。中低濃度組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)未出現明顯應激反應，游動平緩，活動范圍小。8 h后高濃度組的實驗魚游動減緩且身體失衡，漂浮在水面上方，隨著染毒時間延長，身體傾斜，游動減少，最終沉至水底靜止不動直至死亡。

如表2所示，在96 h的急性毒性實驗中對照組的實驗魚均未發生死亡，TPT處理組實驗魚的死亡率均隨藥物濃度升高，實驗時間延長而上升。低濃度組(Ⅰ)的TPT對大鱗副泥鰍的急性致死效應最小，中高濃度組(Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的TPT對大鱗副鰍的急性致死效應較大，且72、96 h中高濃度組的死亡率均為100%。

表2 大鱗副泥鰍在三苯基錫作用下的死亡率Tab.2 The mortality of P.dabryanusexposed to triphenyltin

2.2 LC50和毒性蓄積效應

24、48、72和96 h的LC、CI、MAC和SC結果如表3所示。TPT對大鱗副泥鰍24、48、72和96 h的半致死濃度LC分別為0.086、0.037、0.026、0.019 mg/L，安全濃度SC為0.002 mg/L，藥物蓄積程度系數MAC 隨實驗時間延長而下降，且下降較快。

表3 三苯基錫對大鱗副泥鰍的半致死濃度、藥物毒性蓄積程度系數和安全濃度Tab.3 LC50,MAC and SC of the triphenyltin in P.dabryanus

2.3 TPT與聚苯乙烯聯合的毒性效應

如圖2所示，由TPT單一毒性實驗結果可知，實驗魚的死亡率均隨藥物濃度升高，實驗時間延長而上升。低濃度組(Ⅰ)的TPT對大鱗副泥鰍的急性致死效應最小，中高濃度組(Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的TPT對大鱗副泥鰍的急性致死效應較大，且中高濃度組(Ⅳ、Ⅴ)的TPT分別在暴露了72 h和48 h后誘導了大鱗副泥鰍100%的死亡率。而在與MPS聯合的情況下，低濃度組(Ⅱ、Ⅲ)的72 h和96 h的死亡率顯著下降，中高濃度組(Ⅳ、Ⅴ)100%的死亡率只有在暴露了96 h和72 h之后才能記錄到，中高濃度組(Ⅳ、Ⅴ)100%死亡率較單一毒性結果均有延遲，低濃度組(Ⅰ)和高濃度組(Ⅵ)無顯著變化。表明MPS對TPT的毒性效應具有延緩作用。

圖2 三苯基錫與聚苯乙烯聯合對大鱗副泥鰍的死亡率比較Fig.2 Comparison of mortality between triphenyltin and polystyrene on P.dabryanus不同小寫字母(a,b,c,d)表示同一時間點不同處理組之間的差異顯著(P<0.05)

2.4 三苯基錫和聚苯乙烯聯合暴露的半致死濃度

如表4所示，TPT和MPS聯合暴露對大鱗副泥鰍24、48、72和96 h的LC分別為0.087、0.065、0.041、0.025 mg/L，與TPT單獨暴露相比，聯合暴露48、72和96 h的LC均增大，表明MPS能夠抑制TPT的毒性，表現為拮抗作用。

表4 三苯基錫和聚苯乙烯微塑料對大鱗副泥鰍的半致死濃度Tab.4 LC50 of triphenyltin combined with polystyrene on P.dabryanus mg/L

3 討論

3.1 三苯基錫對水生生物的毒性效應研究

LC是評價污染物對水產動物急性毒性的重要指標，根據魚類急性毒性實驗的96 h LC，有毒物質對魚類的毒性作用分為4級:<0.1 mg/L，劇毒;0.1～1 mg/L，高毒;1～10 mg/L，中毒;>10 mg/L，低毒。林華兵等研究發現三苯基錫對羽搖蚊()幼蟲、小錐實螺()、顫蚓()的24 h LC分別為278.7、249.1、287.8 μg/L，顏天等測得三苯基錫對糠蝦()24 h LC為0.025 μg/L。這些結果都表明低濃度的三苯基錫對水生生物具有很強的毒性。其中王慶偉和張瀟峮等研究發現，三苯基錫對斑馬魚(var)的96 h LC為0.012 mg/L，對胭脂魚()幼魚的96 h LC為0.017 mg/L，而本研究顯示三苯基錫對大鱗副泥鰍的96 h LC為0.019 mg/L，結果非常接近，可見三苯基錫對魚類是劇毒物質，三苯基錫污染會對水生生物產生巨大危害。

MAC常作為生物對毒物敏感程度的指示參數，來分析毒物在生物體內的蓄積和降解情況，當MAC為正值時，蓄積作用強于降解作用，MAC為負值時，降解作用強于蓄積作用，MAC值越大，即毒效蓄積程度越大，生物抗毒能力下降致死率越大，反之亦然。已有研究表明，探討污染物對生物毒性的毒性效應時，應分析毒物蓄積變化，來全面評估污染物的毒性效應。本實驗通過比較三苯基錫MAC值，發現24～48 h段的MAC值最大，表明此時間段內毒性的蓄積作用遠大于降解作用，即死亡高峰段。而后隨著時間的延長，MAC值下降明顯，48～72 h的MAC值是24～48 h的22.9%，72～96 h的MAC值是48～72 h的54.9%，說明隨著暴露時間的延長，大鱗副泥鰍的降解毒效能力增強，毒效蓄積速度下降，表明大鱗副泥鰍對三苯基錫敏感性強。

3.2 微塑料與水環境污染物聯合的毒性效應

眾多研究表明，微塑料能夠與環境污染物相互作用。KIM等研究了兩種微塑料與鎳(Ni)對大型溞()的毒性作用，與鎳單一毒性相比，發現微塑料對鎳毒性有輕微的拮抗作用。KHAN等研究發現微塑料顯著降低了斑馬魚對銀(Ag)的攝取，也顯著增加了腸道Ag的比例。這些結果表明不同的微塑料對不同的環境污染物的吸附能力不同，這與它們表面的性質特征有關。這種吸附可能改變水生生物對環境污染物的利用度和吸收途徑，從而改變其毒性效應。OLIVEIRA等研究表明，微塑料的存在延緩了芘誘導鰕虎魚()的死亡時間，芘單獨暴露，發現最高濃度的芘(200 μg/L)在48 h誘導了100%的死亡，而與微塑料聯合暴露，只有在60 h后才能記錄到100%的死亡率。本研究三苯基錫與聚苯乙烯聯合暴露研究也發現中高濃度組(Ⅵ，Ⅴ)100%的死亡率較三苯基錫單一毒性結果均有延遲且48、72和96 h的半致死濃度LC均增大，表明微塑料對三苯基錫的毒性具有一定的調節延緩作用。微塑料的存在推遲了大鱗副泥鰍的致死時間，但沒有保護其免受死亡，其原因可能是:(I)聯合暴露所涉及的機制是短暫的，只能維持相對較短的時間;(Ⅱ)保護機制只能應對一定水平的三苯基錫濃度，高于這一閾值水平就會造成嚴重的毒性影響，導致死亡。這種聯合作用機制很復雜，需進一步研究微塑料和三苯基錫聯合對大鱗副泥鰍的影響，特別是長期暴露于微塑料和三苯基錫的情況下，研究微塑料對三苯基錫的吸附能力，以及三苯基錫在大鱗副泥鰍不同組織部位的積累，從分子水平上來分析這種聯合毒性效應。