分子標記輔助綏芬河珠星三塊魚提純復壯

趙雪飛，黃 晶，李 乾，梁利群，孫 博，張立民，王維坤，常玉梅

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，淡水魚類育種國家地方聯合工程實驗室，哈爾濱 150070；2.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱 150040； 3.江蘇海洋大學，江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室，江蘇連云港 222005；4.黑龍江省東寧市水產局，黑龍江東寧 157200)

三塊魚()是鯉形目鯉科雅羅魚亞科三塊魚屬幾種土著經濟種的統稱，主要分布于太平洋西北部的日本海及一些內陸淡水河流，包括俄羅斯的濱海省、哈巴洛夫斯克和薩哈林，日本及朝鮮半島，在我國僅分布于綏芬河和圖們江流域。三塊魚是傳統的珍稀名貴魚類，肉質細嫩、肉味鮮美，其中所含的蛋氨酸和賴氨酸等人體必需氨基酸較一般魚類含量高，同時含有豐富的不飽和脂肪酸和維生素A、維生素D等。歷史上，三塊魚與興凱湖的大白魚和烏蘇里江的鮭并稱為“邊塞三珍”。

近年來，由于水域環境遭到破壞，加之污染和酷捕濫撈等人為因素，洄游至我國的三塊魚資源瀕臨枯竭，由曾經的幾十萬尾到目前的幾千尾。為增加三塊魚的野生種群數量，自1989年以來，黑龍江省東寧市水產局通過捕撈洄游產卵群體，采集精卵，實施人工授精和苗種孵化的方式，補充三塊魚野生資源。早期三塊魚洄游產卵群體因婚姻色差異和洄游時間的不同被劃分為3個群體，俗稱“金灘頭”、“銀灘頭”和“黑灘頭”。近年來，我國學者從解剖學、生化及DNA分子標記等多個角度證實，洄游到我國綏芬河產卵的只有2個種群，即俗稱“金灘頭”的珠星三塊魚()和俗稱“黑灘頭”的三塊魚()；而“銀灘頭”實際上是珠星三塊魚、三塊魚及二者少量的雜交個體組成的一個混合群體。

珠星三塊魚和三塊魚表型相近，不易區分，只有在性成熟時，依據洄游時間和婚姻色進行區分，因此極易造成種質混雜。近期研究團隊在結合表型鑒定和分子標記檢測兩種技術判定時就發現，珠星三塊魚種質混雜嚴重，一些個體在表型和基因組層面都出現了三塊魚特有的表型特征和基因痕跡。因此，為保護這一珍貴種質資源，本研究采用了“表型+基因型”相結合的輔助選育技術，對珠星三塊魚野生原種連續兩代進行鑒定，并對比選育和未選育F代生長性狀，以期獲得提純的優質珠星三塊魚種質，為科學指導珠星三塊魚的增殖放流，確保其種質的純正及天然野生資源的可持續利用提供保障。

1 材料與方法

1.1 實驗魚來源及表型鑒定

依據珠星三塊魚的洄游時間，2014年4月下旬，從黑龍江省東寧市綏芬河捕撈洄游產卵的珠星三塊魚野生親魚，分別采集精卵進行人工授精，然后將約3萬粒受精卵帶回至黑龍江水產研究所室內養殖車間進行孵化桶流水孵化，獲得魚苗約6 000尾，經開口馴化后轉至黑龍江水產研究所呼蘭實驗站室外土池(0.2 hm)培養至4齡性成熟。體色鑒別發現這批珠星三塊魚出現兩種體色特征，一種是珠星三塊魚特有體色特征，體側為三條紅線(側線鱗，側線鱗上、側線鱗下)，記為珠星三塊魚野生原種；另一種則為三塊魚特有體色特征，體側為單條紅線(側線鱗下，圖1)，記為珠星三塊魚變異種。分別選取93尾顏色純正的原種和69尾變異種進行電子標記，并剪取鰭條進行mtDNA和核DNA檢測。

圖1 珠星三塊魚原種及變異種Fig.1 Wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

1.2 線粒體DNA COI基因鑒定

DNA提取和線粒體基因引物信息及擴增方法等參考常玉梅等的報道。具體來講，采用線粒體通用引物(F:5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′；R:5′-TAGACTTCTGGG TGGCCAAAGAATCA-3′)對珠星三塊魚野生原種及其變異種共162尾個體進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，其中包含自制PCR buffer mix 18μL(50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、0.10%TritonX-100、1.5 mmol/L MgCl、0.10%NP-40、0.01%明膠、200 μmol/L 4種dNTP)，濃度10 μmol/L的上下游引物各1 μL，DNA聚合酶0.2 μL(Fermentas,5 U/L)，模板DNA 2 μL，去離子滅菌水補至總體積25 μL。PCR反應程序為95 ℃預變性3 min；35個循環包括95 ℃ 15 s，57.7 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至北京諾賽基因公司進行測序。

從GenBank數據庫中下載俄羅斯濱海區珠星三塊魚(isolate Vkk，EU392224.1)和三塊魚(EU392229.1)特有的單倍型序列，然后與本研究中的162條序列合并后采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建基于Kimura雙參數模型(Kimura 2-parameter,K2P)的單倍型進化樹，并經1 000次自展檢驗(Bootstrap)。選用草魚()基因相應片段(NC_010288.1)作為系統進化分析的外類群。

1.3 種質特異DNA分子標記鑒定

為了避免mtDNA因母性遺傳特征而無法高效鑒定雜交種的問題，本研究采用前期已鑒定的三塊魚種質特異性核DNA(Microphthalmia-associated transcription factor a)基因繼續對已完成基因鑒定的珠星三塊魚野生原種進行種質鑒定。同時，根據常玉梅等和趙雪飛等報道的已用分子標記鑒定過的珠星三塊魚和三塊魚野生鰭條樣本(各2尾)作為對照?；蛞镄畔⒓皵U增方法參照趙雪飛等的報道。具體來講，采用基因引物(F：5′-CTGGGGTTGACAAAGAATGGT-3′；R：5′-TGGTGTGTTCGTTTCTGCTG-3′)對88尾珠星三塊魚野生原種進行PCR擴增，PCR反應體系同基因擴增體系，PCR反應程序為95 ℃預變性3 min；35個循環包括95 ℃變性15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后72 ℃延伸10 min。

1.4 分子標記輔助珠星三塊魚原種擴繁

將表型和基因型(線粒體DNA基因型及核DNA基因型)鑒定均為珠星三塊魚野生原種的4+性成熟個體，于2019年5月28日進行人工催產和授精，獲得自交F。隨機抽取30尾子代樣本和30尾親本，進行線粒體DNA基因及核DNA基因雙重鑒定，確定子代種質純正。

1.5 提純子代與未提純子代生長對比

為了觀察提純子代是否存在生長衰退現象，本研究進行了提純子代及未提純子代生長對比實驗。首先將2 600尾提純子代及未提純子代于2019年6月5日分別投放至黑龍江水產研究所呼蘭實驗站兩個0.08 hm室外土池進行分塘飼養，越冬前(4月齡)分別測定體重和體長；然后剪鰭標記后分別挑選1 500尾進行并塘越冬(0.2 hm土池)，次年繼續同塘飼養28個月，每年10月初(16月齡和28月齡)隨機打撈兩種實驗魚分別測定體重和體長。采用Student′s t-test分別評估同一采樣時間點內提純子代和未提純子代的體重和體長差異，顯著性設定為<0.05，所有數據采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 珠星三塊魚野生原種及其變異種線粒體COI基因鑒定結果

將4齡珠星三塊魚野生原種及其變異種共計162尾個體的基因擴增序列進行比對處理，得到有效序列長度為633 bp。單倍型檢測發現，162尾個體共檢測到4種單倍型(圖2)，其中Hap3為主效單倍型，有144尾個體共享，其余3種單倍型，只有5～7尾個體共享(表1)。系統進化樹顯示，珠星三塊魚原種的兩個單倍型Hap3和Hap4與俄羅斯的珠星三塊魚聚為一支；而珠星三塊魚變異種特有的兩個單倍型Hap1和Hap2與俄羅斯的三塊魚聚為一支(圖3)。

圖2 COI基因在珠星三塊魚野生原種及其變異種中的4種單倍型Fig.2 Four haplotypes of COI gene in wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

圖3 珠星三塊魚野生原種及其變異種單倍型系統進化NJ樹Fig.3 Neighbor-Joining tree of haplotypes in wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

表1 珠星三塊魚野生原種及其變異種的單倍型檢測結果Tab.1 The number of haplotypes in wild broodstocks and its variants of T.hakonensis

2.2 珠星三塊魚野生原種核DNA mitfa基因鑒定結果

將單倍型為Hap3的88尾珠星三塊魚原種挑選出來，進一步利用種質特異性DNA標記基因進行核基因組基因污染檢測。結果顯示單倍型為Hap3的人工養殖的珠星三塊魚野生原種個體均擴增出與野外采集的珠星三塊魚一致的條帶，并未出現三塊魚特有的DNA譜帶(圖4)。

圖4 單倍型為Hap3的珠星三塊魚特異的mitfa基因型Fig.4 Specific mitfa genotypes of T.hakonensis with Hap3M為DNA marker 2000；序號1-20為珠星三塊魚原種部分個體

2.3 分子標記輔助珠星三塊魚原種擴繁及子代提純鑒定結果

經線粒體DNA和核DNA雙重分子標記鑒定的88尾原種個體(37♀，51)進行人工催產，結果有55尾個體(25♀，30)繁殖成功。受精卵孵化出F子代魚苗后，隨機選取30尾F子代與30尾親本共同進行和基因雙重鑒定?；蜩b定結果顯示，所有子代與親代均為單倍型Hap3(圖2)；基因鑒定結果顯示，F子代擴增條帶類型與親代保持一致，均為珠星三塊魚野生種特有基因型(圖5)。

圖5 單倍型為Hap3的珠星三塊魚原種親本及其子代特異DNA譜帶Fig.5 Specific DNA bands of original parents and their offspring of T.hakonensis with Hap3 haplotypeM為DNA marker DL2000；親本為珠星三塊魚原種的親本；子代為提純的F1子代

2.4 提純子代生長性狀測量結果

提純子代和未提純子代池塘生長對比結果顯示(表2)，分塘飼養至4月齡和并塘飼養至16月齡時二者體重和體長均無明顯差異。但同塘飼養至28月齡時，提純子代平均體重已增至(256.62±23.28) g，而同齡未提純個體平均體重僅為(217.78±29.39) g，其生長速度顯著低于提純子代。

表2 珠星三塊魚提純子代與未提純子代生長對比情況Tab.2 Growth comparison between purified offspring and unselected offspring of T.hakonensis

3 討論

自上世紀80年代起，就有學者對三塊魚(早期稱之灘頭雅羅魚)的種群生物學和繁殖生物學特性等開展了相關研究。目前雖然已經能夠對人工養殖的兩種三塊魚野生種實現全人工繁殖，但由于珠星三塊魚與三塊魚僅能通過洄游時間和體表的婚姻色進行區分，且野外產卵場地重疊，國內外學者均在野外發現有雜交個體，因而種群存在種質混雜現象。

種質鑒定是水產動物種質資源評估、開發及利用的重要基礎。近年來，隨著生物技術的發展，分子標記技術避免了常規表型鑒定時可能存在的誤差，是目前對種質資源進行更為合理、準確鑒定的重要技術手段。線粒體基因作為物種鑒定的有效基因，因其在不同物種的保守性存在很大差異，被廣泛用于不同種間的種質鑒定。利用該技術，國外學者成功地將三塊魚屬的不同種及地理群體進行了劃分。常玉梅等同樣利用該技術，明確了我國綏芬河珠星三塊魚和三塊魚的分類地位。但是由于線粒體DNA的母性遺傳特性，對存在基因漸滲的群體的鑒定存在偏差，而核DNA分子標記技術則能有效彌補線粒體DNA母性遺傳的不足。因此，國內外學者在區分珠星三塊魚和三塊魚時均選擇采用“mtDNA+核DNA”的兩種基因標記鑒定方法來綜合判定。

為了檢驗珠星三塊魚種質是否純正，本研究在原有的“mtDNA+核DNA”鑒定方法基礎上與表型鑒定方法相結合進行三重鑒定。首先依據表型特征將其劃分為野生原種和變異種，隨后利用基因成功地將162個個體劃分到兩個類群，即93個原種個體和56個變異種個體聚類到珠星三塊魚分支，剩余13個變異種個體則聚類到三塊魚分支，說明2014年引進的珠星三塊魚野生群體確實出現了種質混雜(表2，圖3)，推測這些個體可能是以三塊魚為母本，珠星三塊魚為父本的雜交后代。POLYAKOVA等和SAKAI等曾發現珠星三塊魚在野外常與分布于北海道的三塊魚雜交(10-20%的野生后代是雜種)，且通常三塊魚多為母本參與雜交(85%)，這與本研究結果是一致的。除天然雜交外，不科學的增殖放流也可能是造成珠星三塊魚種質混雜的另一主要原因。

從表型鑒定和基因型鑒定結果可以看出珠星三塊魚種質混雜比較嚴重，162尾個體中有69尾個體都出現了不同程度的混雜。分子標記輔助選育可加快具有特定優良性狀的品種的選育速度，廣泛應用于魚類的遺傳改良。孫效文等利用與體重相關的分子標記進行品種培育，建立了綜合性狀好、生長速度更快的鏡鯉()新品系；FUJI等利用一個與抗淋巴囊腫病相關的微衛星標記9-8輔助牙鲆()繁育，其后代未爆發淋巴囊腫病，而對照組有4.5%～6.3%的發病率。但利用分子標記技術進行種質提純鮮有報道。本研究利用“表型+基因型”逐級遞進的檢測技術成功地對珠星三塊魚野生原種進行了種質提純。連續兩代檢測結果中單倍型均為野生珠星三塊魚特有單倍型Hap3，核DNA擴增譜帶為野生珠星三塊魚特有基因型，無論線粒體DNA還是核DNA均未出現分化，表明珠星三塊魚提純效果佳。另外，通過池塘生長對比，發現經過分子標記輔助選育的F子代平均體重顯著高于同齡的未選育子代(表2)，表明提純F代具有良好的生長性狀。

珠星三塊魚需4齡才能達到性成熟，采用傳統的表型選擇的方法進行提純復壯，周期過長，而且不能保證種質純正。如果采用本研究的“表型+mtDNA+核DNA”三重鑒定輔助選育技術，則可以克服傳統選育方法中的弊端，大大提升珠星三塊魚種質的提純速度，有效縮短選育周期，提高提純復壯效率，為珠星三塊魚野生種質資源的恢復、保護及合理利用提供技術支撐和種質保障。