擬南芥Pro:RFE6-GUS載體的構建及其轉基因植株的篩選

孟杏楠, 張 靜, 夏明慧, 曹君璇, 樊婷婷

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

隨著現代工業的飛速發展,工業污染的問題也日漸明顯,其中重金屬(如鎘)向生物圈的排放也日益增大[1],探索重金屬脅迫的作用機理以及提高植物抗重金屬的能力具有重要的理論以及實際意義,而尋找提高植物抗重金屬的關鍵基因并利用轉基因技術對植物品種進行改良是解決重金屬污染的一種行之有效的方法[2]。本文通過鎘脅迫試驗發現,AtRFE6基因敲除后的擬南芥對鎘脅迫有所響應。為了進一步探究基因AtRFE6響應鎘脅迫的機制,本文克隆了AtRFE6基因的啟動子,以GUS蛋白為標記蛋白構建Pro:RFE6-GUS重組質粒,并通過基因工程手段構建Pro:RFE6-GUS轉基因植株,以期通過觀察GUS蛋白在鎘脅迫時的表達量監測AtRFE6基因的表達情況,為進一步探究該基因在擬南芥響應鎘脅迫中的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用植物為野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana),購于美國擬南芥種質資源中心,均為哥倫比亞(Columbia,Col) 遺傳背景,后由合肥工業大學植物分子生物學實驗室繁殖所得。

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購于Thermo Scientific;高保真DNA聚合酶、PrimeScript RT-PCR Kit,均購于Takara;TIANprep Mini Plasmid Kit 、瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒,均購于TIANGEN;限制性內切酶SacⅠ、XhoⅠ、T4-DNA Ligase,均購于NEB;Silwet77購于索萊寶;氯仿、瓊脂、乙醇、異丙醇、酵母粉、蛋白胨、蔗糖,均購于國藥集團;壯觀霉素、卡那霉素、慶大霉素,均購買于生工生物工程(上海) 股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥土培苗的培養

將蛭石、黑土、珍珠巖以體積比為9∶3∶1進行混勻分裝入花盆,待土吸濕完成后,將擬南芥種子用牙簽均勻點在土層表面,再用保鮮膜封盆,隨后置于光照培養室中培養,待擬南芥發芽并生長至4片葉子即可揭膜。其中光照培養室的條件[3]為培養溫度25 ℃,光照16 h、黑暗8 h。

1.2.2 基因組DNA的提取

取擬南芥葉片約0.2 g于EP管中,破碎葉片并加入400 μLSDS提取液,4 ℃,10 000g離心10 min,再取200 μL的上清于EP管,加入200 μL的異丙醇,室溫10 000g離心5 min,棄上清,留沉淀,于通風櫥中吹5～8 min晾干。向EP管中加入40 μL的雙蒸水,即得到DNA。其中SDS提取液配制時,每200 mLSDS提取液中加入40 mL pH值 7.5、濃度為1 mol/L的Tris-HCl溶液,12 mL濃度為4 mol/L的NaCl溶液,10 mL濃度為0.5 mol/L的EDTA溶液以及4 mL 20%的SDS溶液,再用134 mL雙蒸水補足至200 mL。

1.2.3RFE6啟動子片段的克隆

利用Oligo7引物設計軟件設計引物:

FP:5’-CGAGCTCGTGTGAACTTTATTTTG-3’,

RP:5’-CCGCTCGAGTGATAAAATTTTCAAAA-3’。

以野生型擬南芥DNA為模板,進行基因克隆。設置聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)條件為98 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,進行基因克隆,32個循環完成后,進行跑膠電泳。

1.2.4 載體的構建

酶切所用體系為50 μL,分別取43 μL克隆基因片段和20 μL的質粒加入2個EP管中,再加入5 μL的Cutsmart、SacⅠ和XhoⅠ內切酶各1 μL,質粒用雙蒸水補足至50 μL,置于37 ℃金屬浴中進行酶切,其中片段酶切2 h,質粒酶切4 h[4]。將GUS載體質粒與克隆所得片段雙酶切,膠回收后以質粒與片段質量比為3∶1的比例用T4-DNA Ligase進行16 ℃連接16 h。取5 μL的連接產物加入大腸桿菌DH5α感受態中,冰浴30 min,再42 ℃熱激50 s,隨后立即冰浴2 min。再加入700 μL無抗性的液體LB培養基,37 ℃活化1 h后涂布于含壯觀霉素抗性的固體LB培養基上,37 ℃培養過夜,待長出單克隆菌落后,挑取單克隆菌體于50 μg/mL壯觀抗性的液體LB培養基中培養至渾濁再進行PCR鑒定,鑒定所用的引物為:

FP:5’-CGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG-3’,

RP:5’-TGATAAAATTTTCAAAA-3’。

板澗河調蓄水庫已具備蓄水條件，為下閘蓄水驗收奠定了基礎。運行中要加強觀測、分析，發現問題及時處理，保證水庫、大壩的安全運行，充分發揮小浪底引黃工程效益。

鑒定完成后選取陽性菌落進行測序。

1.2.5 轉基因植株的構建

載體構建完成并且測序比對正確后,將質粒電轉入農桿菌GV3101感受態中,活化后均勻涂布于50 μg/mL慶大霉素和壯觀霉素雙抗性LB培養基上,于28 ℃培養箱中倒置培養2 d左右,待長出農桿菌單克隆菌落后,挑取單克隆菌體于液體雙抗LB培養基中培養并鑒定,鑒定正確即可轉接至100 mL的雙抗LB液體培養基中培養至OD600=0.6。將農桿菌菌液常溫下3 000 r/min離心10 min集菌,再用緩沖液(每100 mL 雙蒸水加0.218 g 1/2 MS培養基、6 g蔗糖)清洗2遍菌體,最終用緩沖液重懸菌體至OD600=0.4左右,每4 mL菌液中加入1 μL Silwet77,實驗菌液即制備完成。實驗所用的材料為土培4周的野生型擬南芥,剪去成熟的果莢,只留下花苞,將花苞浸入菌液中30 s,用保鮮膜封閉后黑暗處理過夜,第2天揭去保鮮膜。1周后再次侵染。

1.2.6 轉基因植株的篩選

在收獲擬南芥侵染后的的F0代種子后,置于37 ℃培養箱烘干2周,除去雜質,再放于4 ℃冰箱春化約1周即可用于篩選實驗。篩選陽性植株所用的培養基為1/2 MS培養基和50 μg/mL那霉素抗性培養基,配置時每100 mL 水加入0.218 g1/2 MS培養基、1 g蔗糖和1.2 g瓊脂。將混合液pH值調至5.8后,置于滅菌鍋中121 ℃、20 min滅菌完成,待培養基冷卻至60 ℃左右,加入100 μL質量濃度為50 mg/mL的卡那霉素無菌溶液,混勻后均勻倒入培養皿中,待培養基凝固吹干皿蓋水分。擬南芥種子用0.1%的HgCl2洗滌30 s除去細菌,隨即用無菌水沖洗3遍沖去殘余HgCl2,將種子鋪在濾紙上晾干即可開始播種。播種完成的培養皿封口置于4 ℃春化2～3 d后即可水平置于光照培養箱培養2周。2周后選取培養基中根系發達,葉片嫩綠的陽性植株移入土培。待幼苗長大后即可采葉片提取DNA進行鑒定。

1.2.7 擬南芥植株GUS染色

將待染色的材料置于90%的丙酮溶液中真空抽濾0.5 h,用雙蒸水沖洗3遍,用濾紙吸干殘余在植物表面的雙蒸水,再用試劑盒對材料進行染色。實驗所用的試劑盒為北京華越洋GUS染色試劑盒。

2 結果分析

2.1 RFE6啟動子片段的克隆

圖1 擬南芥RFE6啟動子片段的克隆

2.2 目的片段和GUS質粒的雙酶切

用內切酶分別對質粒和克隆片段酶切以后,將酶切產物進行電泳實驗,結果如圖2所示,由圖2可知，酶切產物完整無雜帶且無拖尾現象,酶切效果良好,將酶切產物膠回收后,使用T4-DNA Ligase對片段和質粒進行16 ℃連接16 h。

圖2 基因和質粒雙酶切

2.3 重組質粒單克隆菌落的PCR鑒定

將連接產物轉入大腸桿菌,涂于壯觀霉素抗性LB固體培養基上,挑取單克隆菌落于壯觀霉素抗性液體培養基中培養至渾濁即可進行菌落PCR鑒定，結果如圖3所示。

由圖3可知，擴增條帶大小與目標條帶一致,選取PCR條帶清晰的單克隆菌體進行測序,測序比對正確后擴大培養,并且用質粒提取試劑盒提質粒,即得到Pro:RFE6-GUS重組載體質粒。

圖3 大腸桿菌菌落PCR鑒定

2.4 農桿菌陽性克隆的PCR鑒定

將測序正確陽性質粒轉入農桿菌,活化后涂于雙抗性LB固體培養基上,28 ℃培養2 d左右,挑取單克隆于液體雙抗性培養基里培養至渾濁即可進行PCR鑒定,結果如圖4所示。從圖4可以看出，條帶清晰明亮,說明質粒已成功轉入農桿菌。

圖4 農桿菌菌落PCR鑒定

2.5 轉基因植株的篩選及鑒定

利用農桿菌通過浸花法侵染野生型擬南芥后,將所獲得的種子種植于含有卡那霉素抗性的1/2MS培養基上進行篩選,如圖5所示。從圖5可以看出，侵染成功的轉基因植株能夠正常生長,野生型植株則出現葉片黃化偏小,且根系不發達等非正常生長現象。

圖5 轉基因陽性植株抗性篩選

正常生長的幼苗于培養皿里生長2周后移至土培生長。同時,為排除植株出現假陽性,在轉基因植株生長至4周左右時轉基因植株提DNA進行PCR鑒定,以排除假陽性植株。

2.6 Pro:RFE6-GUS轉基因植株染色

Pro:RFE6-GUS轉基因植株GUS染色結果如圖6所示。

從圖6可看出,Pro:RFE6-GUS轉基因植株種子于無抗性的1/2 MS培養基上豎直培養7 d后,一組用濃度為50 μmol/L的CdCl2溶液處理6 h,另一組作空白對照,然后對2組樣品進行GUS染色,從結果可以看出,未處理的擬南芥幼苗染色偏淺,且只有根部染上了淺藍色,而經過CdCl2處理6 h的幼苗染色偏深,且除了根以外,葉和莖都染上了顏色。說明當擬南芥被鎘處理后,植物為應對鎘脅迫啟動了AtRFE6的表達,從而增加了GUS蛋白的表達量。

圖6 Pro:RFE6-GUS轉基因植株GUS染色結果

3 結 論

鎘作為一種有毒的非必需金屬,對人和動物都有毒害作用[5-7],環境中的鎘污染主要來源于工業和農業,鎘在動物和植物體內的半衰期[8]能達到20～30 a。農田被鎘污染后,環境中的鎘被植物吸收,不僅會影響植物的生長,同時會隨食物鏈富集到人類體內,造成不可逆的傷害[9-10]?？寺≈参锬玩k關鍵基因并闡明其作用機制,對于利用植物修復基因工程技術治理土壤重金屬污染具有重要的理論意義和潛在應用價值。擬南芥基因AtRFE6能夠對鎘脅迫作出應答,在植物體內可能通過改變自身和相關基因表達量以及相應蛋白活性來調節對鎘脅迫的響應。因此,探究AtRFE6在應對鎘脅迫中的響應及其作用機理具有重要意義。