奶豆腐制作過程中細菌多樣性與風味物質研究

達林，蘇馨,2，劉文俊,2，孟和畢力格*

1(內蒙古農業大學,乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特，010018)2(農業農村部奶制品加工重點實驗室，內蒙古 呼和浩特，010018)

奶豆腐是原料生鮮乳經蒙古族傳統工藝制成的奶酪類制品。產自內蒙古錫林郭勒盟正藍旗的奶豆腐被批準為國家地理標志產品，因其擁有獨特的風味和質構而備受區內外消費者的青睞。通常奶豆腐的制作工藝是先將未經熱處理的鮮牛乳自然發酵酸化凝乳，之后對發酵乳進行脫脂處理即分離去除其奶油層，再對發酵乳進行熱處理使乳清析出去除，再繼續加熱并不停地攪揉使乳蛋白變性，乳蛋白黏性增加且呈拉絲狀時立即裝入模具，冷卻成型后脫離模具并放置陰涼處干燥、成熟，即可食用。蒙古族傳統奶豆腐制作工藝的關鍵點在于前期鮮牛乳的發酵和后期工藝中的熱處理成型、成熟等操作，源自原料鮮牛乳及制作環境中的乳酸菌參與構建奶豆腐的菌群并對奶豆腐獨特風味特征的貢獻較大[1]。

蒙古族傳統工藝制成的奶豆腐在工藝上與我國新疆哈薩克族和國外中東中亞地區加鹽制作的工藝有明顯的差異[2]。不同地區傳統奶豆腐因其制作環境及貯藏條件等因素的差異，其細菌菌群也有顯著差異。任冬艷等[3]對蒙古國部分奶酪經細菌多樣性分析發現了76個菌種，其中豐度較高的菌種除了常見的乳酸菌外還有一些腸桿菌，這與意大利和俄羅斯布里亞特地區奶酪菌群的結構不同。洋洋等[4]從蒙古族奶豆腐中分離到的優勢乳酸菌菌種主要以德氏乳桿菌和乳酸乳球菌為主，并用電子舌和電子鼻等測定其風味特征，認為奶豆腐樣品間苦味差異較大。目前奶豆腐在我國消費市場遠未飽和，主要原因與其生產規?；潭容^低和產品品質參差不齊等因素有關，對傳統工藝進行機械化、現代化、標準化才能夠提升其市場競爭力和產品品質。本研究選擇錫林浩特市具有典型特色的奶豆腐加工作坊，動態采集原料乳及其奶豆腐加工各階段樣品，對其進行乳酸菌菌株分離，同時分析其間細菌群落結構的變化規律以及揮發性風味物質，以期為奶豆腐加工技術的優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

在錫林浩特市選擇兩家奶食品加工作坊，其中一家為在錫林浩特市區內正藍旗奶豆腐作坊(XS)，另一家為位于錫林浩特市周邊寶力根蘇木的奶食品廠(XB)。采樣時，隨奶豆腐制作工序采集了原料鮮牛乳、發酵乳、嚼克(牛乳發酵過程中浮于上表層的奶油)、熱處理過程中的發酵乳、乳清和奶豆腐成品等樣品用于試驗分析，詳見表1。

表1 奶豆腐等樣品信息表Table 1 Information of hurood and other samples

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品中乳酸菌分離鑒定與活菌計數

樣品中乳酸菌分離和計數分別采用涂布法、傾注法。將12份樣品用生理鹽水進行梯度稀釋，分別取10-5、10-6、10-7梯度稀釋液各1 mL于無菌Φ90 mm培養皿中，傾注含有多粘菌素和放線菌酮的MRS瓊脂培養基與樣品稀釋液混勻待凝固后倒置平板于厭氧工作站(氣體條件為CO2∶H2∶N2=10%∶10%∶80%)中 30 ℃ 培養48 h。計數板按梯度計算即為1 mL樣品的菌落數。從計數板和涂布板上挑選出革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的單菌落于MRS液體培養基中30 ℃培養48 h，劃線純化培后的菌株經擴培后離心收集菌體，加入含0.1%谷氨酸鈉滅菌脫脂乳保護劑，分裝于凍存管和無菌安瓿管中，液氮速凍后于-80 ℃冰箱中凍存備用[5]。

乳酸菌菌株基因組DNA的提?。翰捎肨IANamp細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離株基因組DNA[6]。采用微量紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳進行基因組DNA純度和濃度的檢測，若乳酸菌DNA的OD260/280值在1.8～2.0即為質量較好的DNA樣品。將檢測合格的DNA稀釋至100 ng/μL 用于16S rRNA的擴增。所用16S rRNA基因序列通用引物為：正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。PCR反應體系(50 μL)：正、反向引物(10 μmol/L)各1.5 μL，模板DNA(<100 ng)1.5 μL，KAPA Mix 25.0 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；98 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 2 min。PCR擴增完畢后，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后在凝膠成像儀上進行條帶的觀察，若在1 500 bp處條帶清晰、明亮且無拖尾現象，則視為PCR 擴增產物符合測序要求。將擴增成功的PCR產物送樣上海美吉生物醫藥科技有限公司進行雙向測序。測序獲得的序列文件利用DNA Star軟件中SeqMan模塊進行序列整理和拼接，利用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行分離株的16S rRNA 基因序列同源性比對，同源性>99%的則可視為同一菌種[7-8]。

1.2.2 細菌DNA的提取與16S rRNA基因片段的擴增

使用OMEGA EZNA?Soil 微生物宏基因組 DNA 提取試劑盒抽提樣品中的宏基因組DNA，對提取后的DNA進行純度、濃度的檢測，滿足條件后進行16S rRNA基因片段的PCR擴增[9]。

1.2.3 構建文庫與上機測序及生物信息學分析

各樣品的PCR產物經純化后進行質量混合等操作后，用 Pacific Biosciences Template Prep Kit 2.0 構建DNA文庫，使用Calculater v2.3.3 軟件計算出引物和聚合酶的添加量，加入文庫中，混勻后上機，使用PacBio RS Ⅱ 測序儀進行測序。使用SMRT?Portal(V2.7)中RS ReadsOfInsert.1對擴增成功的原始下機數據進行測序質控，保留符合以下標準的序列：(1)最小通過率設定為5；(2)最小預測精確度為90；(3)最短插入序列長度為1 400 bp；(4)最大序列長度為1 800 bp。采用 PyNAST 將質控結束的序列校準排齊，使用UCLUST algorithm在>97%的相似性條件下劃分操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)。去除屬于嵌合體OTU后，使用RDP(ribosomal database project，Release11.5)、Sliva(v128)及 Greengenes(v13.8)數據庫確定各OTU的分類學地位，進而計算各樣品細菌在門、綱、目、科、屬和種水平的相對含量。計算各組樣本Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和發現的物種數量指數(Observed species)，用于評估α多樣性?；赨nifrac距離對樣品之間進行加權(weighted)和非加權(unweighted)的主坐標分析(principal coordinate analysis，PCoA)[10-11]。

1.2.4 奶豆腐制作過程樣品中揮發性風味物質測定

通過SPME-GC-MS技術對奶豆腐加工過程中不同階段的揮發性風味物質進行測定。將3.0 g待測奶豆腐樣品裝入15 mL無菌萃取瓶中，置于50 ℃水浴中平衡30 min，然后將老化好的纖維萃取頭插入萃取瓶中進行萃取。萃取結束后取出萃取頭，插入GC汽化室中進行GC-MS分析，為保證實驗結果的穩定性，每個萃取條件重復實驗3次。GC條件：采用HP-5毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為He，流速為1 mL/min。色譜柱升溫程序為：起始柱溫35 ℃，保持3 min，以5 min溫程升到100 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升到150 ℃，最后以8 ℃/min溫程升到230 ℃，保持3 min。不分流進樣。MS條件：電離方式為EI源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描模式全掃描，質量掃描范圍m/z20～350[12]。

2 結果與分析

2.1 樣品中乳酸菌的分離培養與活菌計數

奶豆腐制作過程中不同采樣時間點的12份樣品共計分離得到166株乳酸菌，如表2所示，包括嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、乳明串珠菌(Leuconostoclactis)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。如圖1所示，在傳統奶豆腐的制作過程中，乳酸菌菌落總數整體保持在4～9 lgCFU/mL。在發酵乳和嚼克中乳酸菌活菌數達到最高(8～9 lgCFU/mL)；在加熱發酵乳和成品奶豆腐中活菌數降至最低(4～5 lgCFU/mL)；原料鮮牛乳和乳清之間的活菌數集中在(6～8 lgCFU/mL)。

表2 奶豆腐加工過程中不同時間點樣品分離乳酸菌菌株數統計Table 2 Lactic acid bacteria isolated from hurood samples at different processing point

圖1 奶豆腐加工過程中不同時間點樣品的乳酸菌活菌數Fig.1 Viable count of lactic acid bacteria in hurood at different processing point

2.2 奶豆腐制作過程樣品中細菌多樣性分析

所有樣品中的細菌在門水平上主要隸屬于厚壁菌門(Firmicutes，93.6%)、變形菌門(Proteobacteria，4.7%)和擬桿菌門(Bacteroidetes，1.2%)；在屬水平上共檢測到109個菌屬，其中平均相對含量>1%的菌屬為乳球菌屬(Lactococcus，74.5%)和鏈球菌屬(Streptococcus，17.4%)；在種水平上共檢測到237個細菌種，其中每類樣品平均相對含量>1%細菌菌種有9個分別為：乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、魚乳球菌(Lactococcuspiscium)、棉籽糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)、馬其頓鏈球菌(Streptococcusmacedonicus)、唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)、解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)、約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。六類樣品中細菌在種水平的組成如圖2所示。

圖2 奶豆腐加工過程中基于種水平上不同時間點的細菌菌群相對含量Fig.2 Relative abundance of bacterial flora at species level in hurood at different processing point

該研究通過α多樣性分析奶豆腐制作過程中各樣品種細菌群落多樣性、豐度和均勻性，各樣品細菌α多樣性指數如表3所示，在此過程中菌群多樣性的變化在兩組樣品中一致：原料鮮牛乳經自然發酵后α多樣性指數全部降低，發酵乳經加熱排凈乳清后α多樣性指數全部升高，冷卻成型后α多樣性指數又全部降低。

表3 奶豆腐加工過程中不同時間點樣品α多樣性的比較Table 3 α diversity comparison of hurood at different processing point

該研究通過β多樣性對奶豆腐制作過程不同階段樣品的微生物菌群多樣性進行比較，基于Weighted UniFrac距離進行細菌群落PCoA。細菌菌群結構如圖3所示,發酵前(XB1、XS1)兩組樣品差異較大，發酵后(XB2、XS2)兩組樣品差異較小，加熱處理時(XB3、XS3)兩組樣品差異較小，奶豆腐成品時(XB6、XS6)兩組樣品差異較小且與發酵時(XB2、XS2)菌群結構相似。將樣品相對應的坐標點隨奶豆腐制作工序依次連接后發現：在原料鮮牛乳經發酵、加熱和成型的3個主要制作過程中，兩組樣品在空間上呈排布相似的趨勢。

2.3 奶豆腐加工過程樣品中揮發性風味物質測定

所有樣品中共檢測到62種揮發性風味化合物，如圖4所示，奶豆腐加工過程中各類揮發性風味物質總量，其中包括酸類化合物10種，醛類化合物7種，醇類化合物9種，酮類化合物13種，酯類化合物9種，芳香族化合物及其衍生物7種，其他合物7種。酸類化合物主要有乙酸、丁酸和辛酸等；醛類化合物主要有乙醛、戊醛和壬醛等；醇類化合物主要有3-甲基-1-丁醇、3-甲基-3-壬醇和4-甲基-1-己醇等；酮類化合物主要有乙偶姻、2-庚酮和5-羥基-2,7-二甲基-4-辛酮等；酯類化合物主要有乙酸乙烯酯、己酸乙酯和鄰苯二甲酸環丁基十三酯等；芳香族化合物及其衍生物有甲苯、苯乙醇和苯乙醛等；其他化合物主要為胺類化合物，如二甲胺、甲酰胺和甲氧基苯基肟。

圖3 基于非加權的UniFrac奶豆腐加工過程中不同時間點樣品菌群結構的主坐標分析Fig.3 Principal coordinate analysis on unweighted of bacterial flora of hurood at different processing point

圖4 奶豆腐加工過程中各類揮發性風味物質總量Fig.4 The total amount of various volatile flavor compounds of hurood at different processing stage

為探究菌群對樣品產生揮發性風味物質的影響，對它們之間的共變化趨勢進行分析，經Procrustes轉換和顯著性檢驗發現兩者之間相關性顯著(P<0.05)，對篩選得到的菌群與揮發性風味物質之間進一步分析，如圖5所示。L.lactis與乙酸顯著正相關(P<0.01)，與異丙胺顯著負相關(P<0.01)，與丙酮和2-乙基己醇顯著負相關(P<0.05)；S.thermophilus與甲酰胺、2-甲基-4,6-辛二炔-3-酮、2,3-丁二醇、2-庚酮顯著負相關(P<0.05)；L.piscium與2,3-戊二酮顯著正相關(P<0.001)，與戊酸乙酯和1-辛硫醇顯著正相關(P<0.01)；R.ornithinolytica與乙酸顯著正相關(P<0.01)；L.raffinolactis與戊酸顯著正相關(P<0.01)；A.johnsonii與4-甲基-1-己醇顯著負相關(P<0.01)；E.faecalis與苯乙醇顯著正相關(P<0.01)；S.salivarius與2,3-丁二醇顯著負相關(P<0.01)。

圖5 奶豆腐加工過程優勢菌種和揮發性風味物質的相關性分析Fig.5 Correlation analysis between dominant strains and volatile flavor compounds of hurood

3 討論

該文通過純培養分離鑒定方法和PacBio SMAT測序技術，探究了奶豆腐從原料乳至成品整個制作過程中細菌菌群多樣性，研究了風味物質的組分和含量的變化情況，并分析了菌群結構與揮發性風味物質之間的相關性。奶豆腐制作過程中微生物群落的生長與代謝均會隨發酵過程中溫度、pH及環境條件等改變而相應變化。乳酸菌在生鮮乳發酵期間迅速生長而使pH降低[13]，在發酵乳和嚼克時活菌數達到峰值為8～9 lgCFU/mL：隨后呈現下降趨勢直至4～5 lgCFU/mL，這是由于發酵完成后很多微生物因加熱導致生長受到抑制甚至死亡[14]。在整個過程中所有樣品，通過分離培養得到最多的菌種為L.lactis和S.thermophilus，與通過PacBio SMAT測序技術得到的結果一致，該兩種乳酸菌為樣品中的優勢細菌。在種水平上，原料鮮牛乳中的菌種豐富度明顯大于發酵乳，其中L.raffinolactis、L.piscium和A.johnsonii的相對含量在原料鮮牛乳中最高，L.piscium在XB1中的相對含量高達50.4%，但并沒有通過分離培養得到，是因為該菌為嗜冷乳酸菌[15]，而該研究中培養溫度為30 ℃；A.johnsonii為條件致病菌，可引起人與動物感染發病廣泛分布于水、土壤等環境中[16-17]，說明原料乳與外界接觸造成了一定程度的污染，原料乳經室溫自然發酵之后由于L.lactis和S.thermophilus數量的增多導致這3種細菌的生長受到抑制甚至消亡，由于相對含量的變化菌種豐富度便明顯降低。原料鮮牛乳發酵后相對含量最高的菌種為L.lactis，該菌種也是后續工藝中含量最多的菌種。E.faecalis廣泛分布于環境中[18]，其在發酵過程中相對含量最高，隨著后續工序的進行僅檢測到痕量。發酵乳經40 ℃左右進行加熱排凈乳清時，S.thermophilus相對含量明顯升高，而其他菌相對含量均降低，在成品奶豆腐中S.thermophilus相對含量明顯降低，L.lactis在此時又成為相對含量最高的細菌。來源自人體S.salivarius[19]在產品奶豆腐時消失，而之前的制作過程中均不同程度地被檢測到。S.salivarius、R.ornithinolytica、A.johnsonii和E.faecalis等細菌在奶豆腐制作過程中不同程度地被檢測到，可能是由于在整個過程中通過擠奶、外界環境、器具或者人員接觸污染所致，但是隨著發酵時間的延長和pH的降低，數量快速減少甚至消失。

原料鮮牛乳經發酵、加熱、定型時，XB和XS兩組樣品的α多樣性指數的升降與β多樣性的變化都分別體現一致的規律。兩組奶豆腐制作過程的樣品中：α多樣性指數總體呈現先降低、后升高、再降低的趨勢。原料乳發酵后可能由于L.lactis大量生長且在菌群中占比較高導致4個α多樣性指數均降低；發酵乳加熱時可能由于與環境中加熱器具的接觸從而改變微生物豐度導致4個α多樣性指數均升高；后續過程可能由于S.thermophilus等細菌的減少從而改變微生物豐度導致4個α多樣性指數均降低。通過β多樣性分析即細菌群落主坐標分析，可觀察到在原料鮮牛乳發酵成自然發酵乳，再加熱排凈乳清最終至成品奶豆腐中，對應坐標點連接后在空間上呈排布相似的趨勢。但在發酵和加熱過程中分別產出的副產物即嚼克和乳清，這兩類樣品相對其主產物在α多樣性指數的增減和β多樣性中樣品對應坐標點的空間變化均沒有在XB和XS兩組樣品中呈現一致的規律，這可能是由于這兩種副產物在剔除出工藝流程后是與不同環境下的人員或機器進行接觸，導致菌群結構變化無明顯規律[20]。不同工藝流程點的樣品中檢測到了酸、醛、醇、酮、酯等揮發性風味物質，將檢測到的化合物與菌種基于Procrustes分析對它們之間的共變化趨勢進行分析，結果表明兩者在空間排布上呈現一定的相似性，且相關性顯著(P<0.05)。發酵乳制品中重點關注的化合物為羰基類化合物，其中主要為乙醛、丙酮、乙偶姻，還有脂肪酸類化合物包括乙酸、甲酸和丁酸等[21-22]。該研究發現乙醛和乙偶姻與L.piscium顯著正相關(P<0.05)，丙酮與L.lactis和R.ornithinolytica顯著負相關(P<0.05)，乙酸與L.lactis和R.ornithinolytica顯著正相關(P<0.01)。

4 結論

該文基于Pacbio SMAT測序技術和分離培養方法對奶豆腐從原料至成品的菌群多樣性進行了分析，獲得了乳酸菌菌種資源，并對不同制作階段風味物質含量和組分進行了研究。結果發現奶豆腐在制作過程中其菌群的演替存在特定規律，即各階段α多樣性指數均表現為先降低后升高再降低的趨勢，表明鮮乳中復雜的微生物區系如L.raffinolactis、L.piscium和A.johnsonii等細菌隨著發酵與熱處理的進行其逐漸減少，而對產酸和風味起主要作用的乳酸菌成為優勢菌，特別是L.lactis和S.thermophilus是奶豆腐制作后期和終產品的優勢菌。各階段樣品中優勢菌與風味物質存在顯著的相關性(P<0.05)，其中L.lactis與酸類、酮類等重要揮發性呈味物質呈正相關關系。該研究通過對傳統奶豆腐的制作過程中微生物多樣性與風味物質的研究，為其工藝改良及風味優化奠定了一定的理論基礎。