食品內外部因素對金屬抗菌肽SIF4抑菌活性影響及生物相容性分析

肖懷秋，李玉珍，林親錄，趙謀明，曹丹

1(湖南化工職業技術學院 制藥與生物工程學院，湖南 株洲，412000)2(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510000)3(中南林業科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙，410004)

為使食品免受食源性致病菌或腐敗微生物污染并延長食品保質期，除采用低溫、高鹽(糖)或干燥等傳統手段外，常在食品中添加抗菌保鮮劑以達到預期目的?；瘜W防腐劑因易殘留和存在潛在“三致”危害而受限[1]?？咕囊蚓哂锌咕V廣、抑菌機制獨特和不易產生耐藥性等優勢而成為食品抗菌保鮮領域的研究熱點。食品是一個復雜多變的非線性灰色體系，食品組分、加工參數及貯運條件等內外部因素對抗菌活性發揮可能產生復雜影響。食品酸堿性及表面活性劑等可影響抑菌活性，如Nisin在酸性食品中可發揮較好抑菌活性，而中性或堿性條件則幾乎無抑菌活性，酸處理能顯著降低辣椒籽抗菌肽抑菌活性[2]，Tween-80能增強抗菌能力[3]。食品中金屬陽離子對抗菌活性也可能產生復雜影響，如Fe2+使BSN-37抑菌活性消失[4]、Ag+使蘿卜籽蛋白抑菌活性降低70%[5]、Ca2+可增強花椒籽蛋白抗菌活性[3]，Na+、Mg2+和Ca2+使BSN-37最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)上升6倍以上，Fe3+使MIC輕微下降[6]。前期研究發現，金屬抗菌肽SIF4對金黃色葡萄球菌[7]和大腸桿菌[8]有較好抑菌活性，在模擬食品體系中保持較好抗菌活性[9]，但在食品內外部環境因素變化時抗菌活性衍變規律尚未明晰。本文以金黃色葡萄球菌為指示菌，研究食品內外部環境因素變化對SIF4抑菌活性影響的衍變規律，為其在食品抗菌保鮮中應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

金屬抗菌肽SIF4由課題組制備[7]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC25923)，從菌種保藏中心獲得。牛肉膏、胰蛋白胨，北京博星生物；胃蛋白酶、胰蛋白酶，龐博生物；蛋白酶K，Sigma；其他試劑均為國產分析純。

Infinite M200 Pro多功能酶標儀，Tecan；LDZX-40SAI立式蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫療；BBS-SSC超凈工作臺，濟南騰覽；DH-360電熱恒溫培養箱，北京科偉；HERMLEZ323K冷凍離心機，Hermle。

1.2 實驗方法

1.2.1 相對抑菌活性測定

從菌種保藏斜面用接種環刮取2環S.aureus接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃恒溫振蕩(120 r/min)培養至對數生長期，準確吸取0.1 mL菌液(×108CFU/mL)均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養基表面，將滅菌牛津杯置于培養皿中并加入供試品0.1 mL，4 ℃放置2 h使試液充分擴散至瓊脂層，37 ℃ 恒溫靜置培養24 h并測定抑菌圈直徑。抑菌活性計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1為試驗組平均抑菌圈直徑，cm；A0為對照組平均抑菌圈直徑，cm。

1.2.2 食品內部因素對抑菌活性的影響

(1)溫度對抑菌活性的影響：取2×MIC的SIF4(MIC=0.2 μg/mL)5 mL，于25、37、50、60、70、80、90、100、121 ℃分別處理30 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合(SIF4終濃度為1×MIC，下同)并測定相對抑菌活性。

(2)pH變化對抑菌活性的影響：參考WU等[10]方法并略作修改。取2×MIC SIF4若干份，用1 mol/L HCl或NaOH將pH調至2～12，室溫放置1 h，pH回調至7.0，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

(3)金屬陽離子對抑菌活性的影響：參考BOZIARIS等[11]方法并稍微修改。取SIF4若干份溶于0～200 mmol/L CaCl2、MgCl2、KCl和NaCl溶液(pH 7.4)中，使終濃度為2×MIC，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

1.2.3 食品外部因素對抑菌活性的影響

蛋白酶對抑菌活性的影響：參考KIM等[12]方法并略作修改。于2×MIC SIF4溶液中分別加入胃蛋白酶(37 ℃，pH 1.5)、胰蛋白酶(37 ℃，pH 8.5)和蛋白酶K(55 ℃，pH 7.5)，使酶終質量濃度分別為0.001、0.01、0.1、1 mg/mL，溫育30 min后100 ℃滅酶5 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

反復凍融對抑菌活性的影響：將2×MIC SIF4進行反復凍融(-20 ℃凍結，常溫解凍，凍融10次)，凍融后于5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

化學試劑對抑菌活性的影響：

(1)EDTA對抑菌活性的影響：配制濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/mL無菌EDTA溶液，加入SIF4使終濃度為2×MIC，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

(2)Tween-80對抑菌活性的影響：配制質量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL無菌Tween-80溶液，加入SIF4使終濃度為2×MIC，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

(3)尿素對抑菌活性的影響：配制濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的無菌尿素溶液，加入SIF4使終濃度為2×MIC，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

(4)十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)對抑菌活性的影響：配制質量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL無菌SDS溶液，加入SIF4使終濃度為2×MIC，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

1.2.4 生物相容性分析(溶血活性分析)

參考STARK[13]方法并修改。取健康家兔血液收集于肝素鈉管中，2 000 r/min離心10 min，倒掉血清，血細胞用預冷PBS(10 mmol/L，pH 7.4，含50 mmol/L NaCl PBS)重懸洗滌3次以除盡血清，血細胞用PBS重懸至8%。將1 024 μg/mL SIF4作2倍稀釋并分別與等體積血紅細胞懸液混合，37 ℃孵育30 min，3 000 r/min離心10 min，1 000 r/min離心10 min后，上清液用多功能酶標儀測定A490nm以觀察紅細胞血紅蛋白釋放程度。以PBS為陰性對照，0.1% Triton X-100為陽性對照。溶血活性計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1為抗菌肽和樣品共育后吸光值；A0為陰性對照組吸光值；A2為陽性對照組吸光值。

1.2.5 試驗數據處理

試驗結果以平均值±標準偏差(n=3)表示，用Origin 2017繪制統計圖，采用SPSS 25.0單因素ANOVA檢驗進行組間均數差異多重比較，兩兩比較方差齊性時采用最小顯著性差異法，非齊性時使用塔姆黑尼T2方法，顯著性水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 食品內部因素對抑菌活性的影響

2.1.1 溫度對抑菌活性的影響

溫度對SIF4抑菌活性影響結果如圖1所示。

由圖1可知，金屬抗菌肽SIF4抑菌活性在25～70 ℃無顯著差異(P>0.05)，80 ℃后略有下降，121 ℃ 仍保持(92.68±0.40)%抑菌活性，說明SIF4經不同溫度處理后，對金黃色葡萄球菌抑菌活性并未發生明顯變化，具備較好熱穩定性，可能是由于SIF4為小分子抗菌肽，高溫處理對結構影響甚微[14]，與朱張洪基[15]報道的SDLH抑菌蛋白熱穩定性結論相悖，該抑菌蛋白常溫表現較好抑菌活性，高溫(50～80 ℃)穩定性較差，可能是由于該抑菌蛋白分子質量較大，高溫處理破壞氫鍵，對空間結構產生影響，從而減弱抑菌活性，多數蛋白在45～50 ℃發生變性，而寡肽熱穩定性相對較好[15]。

圖1 溫度對抑菌活性的影響Fig.1 The effect of temperature on antimicrobial activity注：字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)，字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 pH變化對抑菌活性的影響

pH對SIF4抑菌活性影響結果如圖2所示。

由圖2可知，在pH 2～9，SIF4抑菌活性可保持在(93.98±0.30)%以上，說明SIF4在酸性、中性或偏堿性條件下有較好抑菌穩定性，可用于果蔬汁飲料等酸性食品抗菌保鮮。pH>10抑菌活性顯著降低可能是由于強堿性環境下抗菌肽分子構象發生變化而影響其抗菌穩定性[16]。研究發現，pH=12時仍保持(85.54±0.28)%抑菌活性，說明SIF4具有較好酸堿適應性，在不同食品pH體系中具有較好的應用基礎。鴨小腸抗菌肽在pH=7.0時抑菌活性最強，適用于中性食品體系，偏酸性(pH<6.0)或偏堿性(pH>8.0)食品體系抑菌效果均不理想，林蛙抗菌肽在pH 2～5.6穩定，pH>6抑菌活性明顯下降，pH 8左右出現沉淀，適用中性或酸性食品體系，而辣椒籽抗菌肽在pH≥7時，抗菌活性隨pH升高而顯著升高(P<0.05)，pH=12處理4 h，抑菌活性比對照提高35.38%，適用于堿性食品體系使用，由此也可看出，不同抗菌肽的酸堿適應性存在顯著差異。

圖2 pH值對抑菌活性的影響Fig.2 The effect of pH value on antimicrobial activity

2.1.3 金屬陽離子對抑菌活性的影響

金屬陽離子對SIF4抑菌活性影響如圖3所示。

由圖3-A可知，50～200 mmo/L Ca2+對SIF4抑菌活性無顯著影響(P>0.05)。李心丹等[17]發現，抗菌肽抑菌活性隨Ca2+濃度增加而顯著減弱(P<0.05)且呈良好負相關關系，但也有研究發現，Ca2+可增強抗菌肽抑菌活性，如Ca2+可使BSN-37對沙門氏菌MIC提升6倍以上，對鼠傷寒沙門氏菌MIC提升4倍；由圖3-B可知，50～200 mmo/L Mg2+對抑菌活性無顯著影響(P>0.05)，抑菌活性均保持在(99.28±0.78)%以上。Mg2+對花椒籽抗菌肽有顯著抑制作用且與離子濃度呈正相關關系[16]，抗菌肽VR3在高濃度Mg2+時抑菌活性減弱近40%，且Mg2+比Na+抑菌活性更明顯[18]；由圖3-C可知，K+在50～200 mmol/L，試驗組與對照組抑菌活性均無顯著差異(P>0.05)，與李心丹等[17]結果一致，但與侯曉艷[16]結論不一致，她發現高濃度K+濃度時，NP-5抑菌活性下降了38.46%；由圖3-D可知，在50～200 mmol/L Na+，試驗組與對照組抑菌活性無顯著差異(P>0.05)，與鐘亨任[19]結果一致。結果表明，SIF4抑菌活性不受Na+、K+、Ca2+和Mg2+影響，可能為非金屬依耐抗菌肽[20]。

2.2 食品外部因素對抑菌活性的影響

2.2.1 蛋白酶對抑菌活性的影響

蛋白酶對SIF4抑菌活性影響如圖4所示。

A-胃蛋白酶；B-胰蛋白酶；C-蛋白酶K圖4 蛋白酶對抑菌活性的影響Fig.4 The effect of proteinase on antimicrobial activity

由圖4-A可知，胃蛋白酶處理后抑菌活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，說明SIF4具有較好的胃蛋白酶耐受性。侯曉艷[16]發現，胃蛋白酶可顯著降低NP-2、NP-5和NP-6抑菌活性，coagulin甚至可被胃蛋白酶失活[21]。胃蛋白酶主要作用于芳香族氨基酸，傾向于剪切氨基端或羧基端為芳香族氨基酸和亮氨酸的肽鍵，SIF4具有較好的胃蛋白酶耐受性可能與其金屬螯合載體相對分子質量較小及氨基酸組成有關，可能不含酶切位點[22]。由圖4-B可知，0.001～0.1 mg/mL胰蛋白酶處理后，SIF4抑菌活性與對照組也無顯著差異(P>0.05)，0.1、1.0 mg/mL胰蛋白酶處理后，抑菌活性略有下降，但仍可保持(97.40±0.87)%以上抑菌活性，coagulin可被胰蛋白酶失活[21]。胰蛋白酶主要作用于精氨酸和賴氨酸羧基端，SIF4具有較好的胰蛋白酶耐受性與其氨基酸組成有關，其在食品模擬體系中的穩定性與課題組前期研究的胃腸耐受性結論一致[22]；由圖4-C可知，經0.001、0.01 mg/mL蛋白酶K處理后，SIF4抑菌活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，經0.1、1.0 mg/mL蛋白酶K處理后，與對照組相比有統計意義顯著下降(P<0.05)，但仍分別有(92.52±0.71)%和(87.98±0.54)%抑菌活性，說明SIF4具有較好蛋白酶K耐受性?？咕囊志钚钥杀坏鞍酌窴失活(如bacthuricinF4)[23]或不受蛋白酶K影響(如B.laterosporusS62-9抗菌肽)[24]，抗菌肽酶耐受性的差異與抗菌肽氨基酸序列長短及氨基酸組成有關[23]。

2.2.2 反復凍融對抑菌活性的影響

反復凍融對SIF4抑菌活性影響如圖5所示。

圖5 反復凍融對抑菌活性的影響Fig.5 The effect of freeze-thaw cycle on antimicrobial activity

由圖5可知，SIF4經6次凍融處理后，抑菌活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，抑菌活性為(99.00±0.81)%，隨后略有下降，凍融10次時，抑菌活性仍保持(82.90±0.87)%，表明SIF4具有較好凍融穩定性，與抗菌肽Brevilaterin凍融穩定性一致[25]。凍融穩定性差的抑菌蛋白(肽)應盡量避免反復凍融操作。

2.2.3 化學試劑對抑菌活性的影響

化學試劑對抑菌活性的影響如圖6所示。

A-EDTA；B-Tween-80；C-尿素；D-SDS圖6 化學試劑對抑菌活性的影響Fig.6 The effect of chemical reagent on antimicrobial activity

由圖6-A可知，EDTA在0.2～1.0 mmol/mL時，抑菌活性與對照組均無顯著差異(P>0.05)，表明EDTA對SIF4抑菌活性影響較小。EDTA可破壞陰性細菌外膜脂多糖結構，如EDTA可協同增強Enterocin T1和Plantarcin Q7抑菌活性；由圖6-B可知，Tween-80對SIF4抑菌活性無顯著影響(P>0.05)，與WORAPRAYOTE等[26]結論一致。有研究發現，Tween-80能增強抑菌活性，可能是因為Tween有助抗菌肽在瓊脂平板中充分擴散[24]；從圖6-C可知，0.2～0.8 mol/L尿素對SIF4抑菌活性無顯著影響(P>0.05)，濃度為1.0 mol/L時，抑菌活性仍可保持(97.43±0.54)%，說明尿素對抑菌活性影響較小，與LIU等[27]基本一致，但WORAPRAYOTE研究發現，尿素可顯著降低抗菌肽抑菌活性[26]；由圖6-D可知，0.2～0.4 mg/mL SDS對抑菌活性無顯著影響(P>0.05)，0.6 mg/mL上升到0.8、1.0 mg/mL時，抑菌活性從(98.75±0.41)%略降至(97.97±0.44)%和(97.81±0.75)%，具有較好抑菌穩定性，可能是由于SDS有利于抗菌肽α-螺旋空間結構形成，對維持其空間結構穩定和增強抑菌活性有重要意義[28]。董新穎發現，SDS可顯著降低B.laterosporusS62-9抑菌活性(僅殘存6.69%)，可能是由于該抗菌肽分子量較大，SDS處理可使抑菌蛋白變性，從而顯著減弱其抗菌活性。SIF4經SDS作用后，抗菌活性仍可保持(97.81±0.75)%以上，說明金屬抗菌肽SIF4為分子質量較小的寡聚抗菌肽。

2.3 生物相容性

SIF4對血紅細胞生物相容性結果如表1所示。

表1 SIF4對血紅細胞生物相容性結果Table 1 The biocompatibility of SIF4 on blood cells

研究發現，PBS試驗組未觀察到溶血現象，Triton X-100試驗組溶血率為100%。由表1可看出，SIF4對血紅細胞均具較好生物相容性，表現較低溶血活性，即使在1 024 μg/mL時，溶血活性也僅為(5.48±0.32)%，遠超過其MIC濃度，說明SIF4對動物細胞幾乎無細胞毒性，具有較好生物相容性和生物安全性。

3 結論

抗菌肽能否適應食品內外部環境變化是制約其在食品抗菌保鮮領域中應用的基礎。本試驗以金黃色葡萄球菌為指示菌，研究了食品內外部環境因素變化對抑菌活性的影響。研究發現，金屬抗菌肽SIF4具有較好熱穩定性和酸堿耐受性，常見金屬陽離子對抑菌活性無顯著影響(P>0.05)，胃蛋白酶和胰蛋白酶對抑菌活性影響較小，具有很好胃腸消化酶耐受性，低濃度蛋白酶K處理對抑菌活性無顯著影響(P>0.05)，蛋白酶K濃度增加，抑菌活性有所減弱，但仍可保持較高抑菌活性；有較好的凍融穩定性。EDTA和Tween-80對抑菌活性無顯著影響(P>0.05)，低濃度SDS(<0.4 mg/mL)和尿素(<0.8 mol/L)對抑菌活性無顯著影響(P>0.05)；具有很好的生物相容性和生物安全性，對血紅細胞有極低溶血活性。研究認為，在常見食品內外部因素變化過程中，SIF4可保持較好的抑菌活性和生物相容性，可作為一種新型抑菌劑用于食品抗菌保鮮，可通過抑制致病微生物和腐敗微生物增殖來增強食品的抗菌保鮮，有很好的應用前景。