帕米爾牦牛乳蛋白分離及α-乳白蛋白純化研究

李曉彤，徐兵潔，張進，李彩虹，托爾坤·買買提,2*

1(新疆大學 生命科學與技術學院，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊，830046)2(新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊，830046)

中國的牦牛數量位居全球第一，大約有1 400萬頭牦牛生活在中國高海拔地區。在全球的牦牛中，中國的牦牛占92.8%，在牧民生活中，牦牛的皮毛、肉、奶甚至糞便均發揮著重要作用；除此之外，高原上的牦牛對牧民出行十分重要，是當地經濟發展的重要組成部分[1]。牦牛的生存環境大多為高山、草原，必須適應極寒、高海拔、低氧和高太陽輻射，因而牦牛產奶量和乳成分具有季節性，受品種、奶牛齡、胎次、體況、牧草品質、擠奶時間等因素的影響，其產奶量較低。牦牛乳的脂肪球比普通牛乳大，乳脂含量高，乳中干物質、乳蛋白和乳糖等營養物質的含量比普通牛乳都要高[2]。

我國有關牦牛的研究大都集中在青海高原型牦牛、九龍牦牛、麥洼牦牛和甘肅天祝白牦牛等品種[3]，而對新疆帕米爾牦牛的研究鮮有報道。帕米爾牦牛分布在中國新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州和喀什地區境內的帕米爾高原，平均海拔3500米以上，這里山脈縱橫交錯，地形崎嶇復雜，冬季漫長，氣溫低。高原上廣闊的牧場和山地冰川滋養了帕米爾高原上的牦牛。牦牛乳是當地常見的乳源，它為人們提供重要的蛋白質、脂肪和維生素[1,4]。從嬰幼兒到老年人，帕米爾牦牛乳始終是當地居民重要的食物來源，且關于帕米爾牦牛乳過敏的癥狀較為少見。有報道稱牦牛乳有抗疲勞[5]、調節全身免疫反應的作用；能抑制與缺血性心血管疾病和Ⅱ型糖尿病有關的普氏菌的生長，降低某些代謝性疾病和傳染病發生的風險[6]。另外，本課題組前期研究發現，帕米爾牦牛乳中蛋白質含量較高(4.3%)。牦牛乳酪蛋白水解物具有清除自由基和抗炎功效[7]。酶解后的牦牛乳酪蛋白可形成抗高血壓肽，作為營養強化劑用于高附加值功能性食品的生產[8]。乳清蛋白含有乳中大部分營養成分，由于其具有豐富的生物活性以及突出的功能特性，可成為多種食品組分的替代品，同時也作為一種可靠的蛋白質來源，在食品行業中發揮重要作用[9]。乳清蛋白中的α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-La)含有色氨酸、賴氨酸等人體必需氨基酸，能夠結合Ca2+、Zn2+等金屬離子，促進礦物質吸收，還具有調節乳糖合成的作用[10-11]。

本研究旨在對帕米爾牦牛乳乳清蛋白和酪蛋白進行分離，并對α-La進行分離純化，以期為帕米爾牦牛乳的研究提供理論支持，促進新疆帕米爾牦牛產業發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2019年7月從新疆維吾爾自治區克孜勒蘇柯爾克孜自治州阿合奇縣牧場采集100頭帕米爾牦牛乳樣本，混合后于-80 ℃冷凍保藏備用。

二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、預染蛋白質Marker，北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(R250)，南京三舒生物科技；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，上海依赫生物；甘氨酸，蓋德化工；三異丙基硅烷(Tis)，上海源葉生物科技有限公司；甲醇、冰醋酸，天津富宇精細化工。

1.3 儀器與設備

FD-1A-50真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；NKY6120凱氏定氮儀，上海鴻祎；TS-80C搖床，上海天呈；DYY-6C垂直電泳，北京六一生物；QUANTUM-CX5凝膠成像儀，法國Vilber公司；RC-LX-HR165A離心機、MULTISKAN Sky全波長掃描酶標儀，美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 新疆帕米爾牦牛脫脂乳的制備

新疆帕米爾牦牛乳于4 ℃解凍，取解凍后牦牛乳樣品離心，設定參數為：9 000 r/min，15 min。離心后浮在上層的乳脂肪用紗布過濾去除，重復離心多次直至乳脂肪除凈，得脫脂乳。

1.3.2 乳清蛋白的分離與測定

脫脂乳中加入10%(體積分數)冰醋酸，調節pH至4.6，40 ℃ 水浴30 min，于4 ℃冰箱中過夜后，4 ℃冷凍離心，設置參數為9 000 r/min，15 min。反復多次離心直至完全去除上層乳脂肪后，上清液用紗布過濾，得到乳清蛋白，測定含量。

1.3.3 酪蛋白的分離與測定

取1.3.1中的沉淀，首先溫水洗滌1次，后用蒸餾水洗滌2次，洗滌過程中將酪蛋白進行充分粉碎，將殘留在酪蛋白中的可溶性蛋白充分除去，每次洗滌后離心，設置參數為8 000 r/min，離心5 min，沉淀即為粗酪蛋白。將粗酪蛋白用30%(體積分數)的乙醇清洗、抽濾；再用乙醚、乙醇混合溶液洗滌并進行抽濾；最后用30 mL乙醚洗滌2次并抽濾，置于烘箱中在55 ℃環境下干燥，得到純化后的酪蛋白，使用凱氏定氮進行酪蛋白含量測定。

1.3.4 SDS-PAGE

將樣品與4×變性樣品緩沖液(20 μL)混勻，100 ℃ 水浴保持5 min使蛋白變性，變性結束后在4 ℃ 條件下12 000 r/min離心10 min，取上清備用。配制5%的濃縮膠及12%、15%的分離膠，凝膠的厚度為0.75 mm，取上清溶液，上樣10 μL，蛋白標準分子質量Marker 5 μL。調節初始工作電壓為100 V恒壓，開始電泳。樣品進入分離膠后，工作電壓調至120 V恒壓。當溴酚藍染料前沿遷移至凝膠底部大約0.5 cm時，停止電泳，取出凝膠。用考馬斯亮藍染色液R-250搖床染色40 min后，回收染液，蒸餾水清洗，加入脫色液搖床脫色，更換脫色液，直至顯現清晰的條帶。最后采用BIO-RAD凝膠成像系統拍照成像。

1.3.5 硫酸銨分級沉淀

向乳清蛋白中加入硫酸銨，待溶液飽和濃度達到40%后，在4 ℃下靜置約4 h，離心后沉淀備用。繼續向上清中加入硫酸銨提高溶液飽和度，使其達到50%，不斷重復上述操作，分別收集硫酸銨飽和濃度為50%、60%、70%、80%和90%時的沉淀。將上述沉淀加入10 mL蒸餾水復溶，置于透析袋中在4 ℃下對該緩沖溶液進行透析，每隔2 h換水，并用10 g/L的BaCl2不斷檢測，直到透析液中沒有白色沉淀出現為止。

1.3.6 離子交換層析

柱材的溶脹：稱取10 g DEAE-Sepharose溶于200 mL蒸餾水中，浸泡48 h，使之充分溶脹，備用。柱子規格為16 mm×60 cm。過程如下：

裝柱及平衡：脫氣活化后，裝柱，用離子平衡緩沖液過柱，流速為2.0 mL/min；

上樣：平衡過程中，檢測系統的基線表現穩定不變時，陰離子柱即平衡結束。取適量樣品上樣；

平衡洗脫：未被吸附的雜蛋白用流速為2.0 mL/min的平衡緩沖液進行洗脫；

梯度洗脫：用含0～0.5 mol/L NaCl的連續梯度磷酸鹽緩沖液將吸附能力不同的蛋白進行洗脫，梯度洗脫的流速設定為1 mL/min。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 帕米爾牦牛乳乳清蛋白和酪蛋白的分離及含量測定

采用等電點沉淀法初步分離了帕米爾牦牛乳中的乳清蛋白與酪蛋白，分別測定其含量。如表1所示，脫脂乳中總蛋白質含量為(2.81±0.23) g/100mL，其中乳清蛋白含量為(1.20±0.02) g/100mL，酪蛋白含量為(1.61±0.22) g/100mL，即乳清蛋白和酪蛋白質量比為43∶57。眾多研究發現，牛乳中乳清蛋白與酪蛋白的比例為2∶8，甘肅牦牛為17∶83[12]，人初乳為 8∶2，成熟早期為6∶4，哺乳后期為1∶1[13]，馬乳和驢乳分別為52∶48、55∶45[14]。與這些文獻比較，帕米爾牦牛乳與其他哺乳動物乳清蛋白和酪蛋白比例存在較大的差異，這可能是由于品種、牦牛齡、胎次、體況、牧草品質等多種因素的不同而引起的，但較接近于人乳，因此，帕米爾牦牛乳更適合開發嬰幼兒奶粉。

對帕米爾牦牛乳中蛋白質進行了分離，用分子質量為11～245 kDa的標準標記蛋白來估計其中蛋白質的分子質量(圖1)。通過蛋白質分子質量可以看出，帕米爾牦牛乳中蛋白主要有α-La(12 kDa)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg，18.3 kDa)、酪蛋白(αs-CN 30 kDa、β-CN 25 kDa、κ-CN 21 kDa)、血清白蛋白(serum albumin，SAB，68 kDa)、乳鐵蛋白(lactoferrin，LF，80 kDa)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG，150 kDa)，這些結果與前人文獻結果一致[15]。由圖1能夠看出，酪蛋白在帕米爾牦牛乳中的含量最高，乳清蛋白緊隨其后。將脫脂乳的酪蛋白沉淀后即得到了乳清蛋白，乳清蛋白所含營養物質豐富，是乳清中活性成分的來源，其中含有的α-La、β-Lg、SAB、LF和IgG等均是具有生物活性的功能蛋白[16]，對人類健康發揮著重要作用。

表1 帕米爾牦牛乳中乳清蛋白及酪蛋白含量與純度Table 1 Content and purity of whey protein and casein in Pamir yak milk

M-蛋白Marker；1，2-脫脂帕米爾牦牛乳圖1 帕米爾牦牛乳蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of proteins in Pamir yak milk

2.2 乳清蛋白中小分子蛋白質的分離

乳清蛋白是品質最佳的蛋白之一，它幾乎包含了人生長發育的必需氨基酸，并且有抑制腫瘤[17]、促進骨形成、抑制骨吸收[18]、降血糖[19]等作用，是新一代超級食品，對人體健康有著重大意義。因此，本文對帕米爾牦牛乳清蛋白中的小分子蛋白進行了分離(圖2)。與大多數其他哺乳動物乳一樣，帕米爾牦牛乳乳清蛋白中出現的蛋白質條帶分別為α-La、β-Lg、SAB、LF和IgG，均為乳清蛋白中的小分子蛋白，這些蛋白是具有生物活性的功能蛋白。牛乳、山羊乳與人乳中乳清蛋白含量分別是0.6、0.6和0.7 g/100mL[20]，而帕米爾牦牛乳中乳清蛋白含量[(1.20±0.02) g/100mL]比牛乳和山羊乳多1倍，同時高于人乳，這些表明帕米爾牦牛乳乳清蛋白營養價值高，是一種具有潛在經濟效益的功效蛋白質。

M-蛋白Marker；1、2、3-帕米爾牦牛乳乳清蛋白圖2 乳清蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of whey protein

2.3 酪蛋白中小分子蛋白質的分離

酪蛋白是是良好的蛋白補充劑及添加劑。酪蛋白在乳中與磷酸鈣結合后形成球形復合物而存在，稱為酪蛋白膠束，盡管不同乳中的酪蛋白膠束結構和組成有較大差異，牛乳酪蛋白中含有牛乳中72%的鈣和48%的磷[21]，因此乳中的酪蛋白在改善骨質疏松癥、軟骨病和佝僂病中可能有重大意義。因此，本文對帕米爾牦牛乳酪蛋白中的小分子蛋白進行了分離(圖3)。根據分子質量，判斷圖中出現的蛋白條帶分別為α-CN、β-CN和κ-CN，電泳圖譜未見雜條帶出現，表明等電點沉淀法可以將帕米爾牦牛乳中酪蛋白初步分離。酪蛋白廣泛存在于牛、羊和人等哺乳動物乳中，是人體必須氨基酸和生物活性肽的來源，牛乳蛋白中80%為酪蛋白[22]。與帕米爾牦牛乳中酪蛋白含量[(1.61±0.22) g/100mL]比較，牛乳(2.7 g/100mL)和山羊乳(2.1 g/100mL)酪蛋白含量較高，乳中酪蛋白是主要的過敏原[23]，會導致特應性皮炎或濕疹、鼻炎、哮喘、嘔吐、反復腹瀉、腹痛等反應發生[24]。因此，本研究間接地解釋了新疆、西藏牧民，尤其是帕米爾高原牧民用牦牛乳喂養嬰兒以補充母乳，而不會導致過敏性反應的原因。

M-蛋白Marker；1、2、3-帕米爾牦牛乳酪蛋白圖3 酪蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of casein

2.4 α-La的純化

α-La由乳腺上皮細胞合成，所有哺乳動物乳中均存在，是乳清蛋白中對熱最穩定的蛋白，也是唯一一種能結合鈣的乳清蛋白成分。α-La中含有豐富的必需氨基酸，并且氨基酸的比例、結構和功能特性與人乳都非常相似，可作為功能性添加劑加入奶粉中用來減少與人乳喂養之間的營養差異。此外，α-La色氨酸含量高，因而具有緩解壓力、改善情緒和提高睡眠質量的作用，在嬰兒配方食品、保健食品和藥物中應用廣泛[25]，因此，帕米爾牦牛乳中α-La的分離純化具有重要意義。在α-La的分離純化過程中，由于其分子質量和理化性質與β-Lg相似，所以β-Lg的去除是關鍵一步。

2.4.1 硫酸銨分級沉淀

使用飽和濃度為40%、50%、60%、70%、80%和90%的飽和硫酸銨溶液沉淀乳清蛋白，根據不同蛋白質在不同濃度鹽溶液中溶解度不同來分離蛋白，然后使用SDS-PAGE方法將帕米爾牦牛乳乳清蛋白分級沉淀后得到的組分進行分離，結果如圖4所示。在硫酸銨飽和濃度為40%、50%、60%和70%時，電泳圖譜出現多個蛋白質條帶，表明40%～70%的飽和硫酸銨溶液無法將乳清蛋白分離出來。當硫酸銨飽和濃度為80%時，在分子質量11～20 kDa存在蛋白質條帶，根據分子質量大小初步判定為α-La和β-Lg。硫酸銨分級沉淀未能將帕米爾牦牛乳清蛋白中的β-Lg除去，這與成希飛[26]的結果相符，他在硫酸銨飽和濃度60%時分離乳清蛋白，得到了α-La、β-Lg和牛血清蛋白。當硫酸銨飽和濃度升高至90%時，泳道內基本不存在蛋白質條帶，這表明飽和硫酸銨溶液濃度過高，帕米爾牦牛乳清蛋白已經基本沉淀完全。

將飽和硫酸銨濃度為80%時分離的蛋白質組分和α-La標準品進行SDS-PAGE，結果如圖5所示。帕米爾牦牛乳乳清蛋白組分中的蛋白條帶和α-La標準品的條帶一致，表明飽和濃度為80%的硫酸銨可以將α-La分離出來，但未能完全除凈其中的β-Lg。α-La和β-Lg不易分離，王浩等[27]使用反相高效液相色譜分離脫脂牛乳主要蛋白時，α-La和β-Lg一起洗脫出來，出現的色譜峰小且寬，因此，在α-La的純化過程中，β-Lg成為分離的難點。

M-蛋白Marker；1-硫酸銨分級沉淀后的α-La；2泳道為α-La標品圖5 純化后α-La與α-La標準品SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis diagram of α-La and α-La standard products

2.4.2 DEAE-Sepharose離子交換層析純化α-La

人乳清蛋白中α-La含量最高，占乳清蛋白的36%，幾乎不含β-Lg[28]，乳清蛋白中的β-Lg也是一種過敏原[29]，β-Lg的脫除在乳品加工過程中至關重要。但由于α-La和β-Lg的理化性質相似，分子質量差別也較小，想要將兩者分離是一個難點。離子交換層析是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的離子組分與交換劑上的平衡離子之間進行各種可逆離子交換時的結合力大小的差異而進行分離的一種層析方法。由于蛋白質處于不同的pH條件下帶電狀況不同，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。將硫酸銨飽和濃度為80%時分離出的牦牛乳蛋白組分再用AKTA蛋白純化儀和DEAE-Sepharose離子交換層析進行提純，結果如圖6和圖7所示。

圖6 帕米爾乳清蛋白DEAE-Sepharose離子交換層析圖譜Fig.6 DEAE-Sepharose ion exchange chromatogram

M-蛋白Marker；1-離子交換層析后的α-La；2-α-La標品圖7 DEAE-Sepharose離子交換層析蛋白質峰SDS-PAGE圖譜Fig.7 SDS-PAGE electrophoresis diagram of protein peaks in DEAE-Sepharose ion exchange chromatography

DEAE-Sepharose離子交換層析蛋白質峰截流液的電泳圖譜中只出現唯一的蛋白條帶，且與α-La標準品條帶的分子質量一致。這表明DEAE-Sepharose離子交換層析能夠較完全的除去其中的β-Lg，得到高純度的α-La。蔣紅玲[30]采用DEAE-Sepharose陰離子交換層析先將脫脂牛乳乳清蛋白中α-La洗脫，再將β-Lg洗脫，從而將α-La和β-Lg的混合物有效分離，這結果與本研究結果相符。由此可見，硫酸銨分級沉淀結合層析法對β-Lg的分離效果較好，可用于帕米爾牦牛乳α-La的分離純化。

3 結論

通過等電點沉淀和SDS-PAGE的方法對新疆帕米爾牦牛乳中所含的蛋白進行分離，得出帕米爾牦牛乳總蛋白含量為(2.81±0.23) g/100mL，其中乳清蛋白和酪蛋白的含量分別為(1.20±0.02)、(1.61±0.22) g/100mL，并且乳清蛋白和酪蛋白的質量比為43∶57；再次，飽和度為80%的硫酸銨分級沉淀乳清蛋白可以將α-La分離出來，但伴有β-Lg；因此，再用DEAE-Sepharose離子交換層析分離提純后，可將β-Lg完全除去，得到高純度的α-La，以上結果為新疆帕米爾牦牛產業的發展提供了理論支撐，為當地牧民經濟收入的提高做出一定的貢獻。