基于頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜技術的鹵烤兔肉丁加工過程中揮發性風味物質變化分析

廖林，劉悅，賀稚非,2，李洪軍,2*

1(西南大學 食品科學學院，四川 重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，四川 重慶，400715)

兔肉具有較好的營養特性，有三高三低的優點，即高蛋白、高多不飽和酸、高消化率、低脂肪、低膽固醇、低能量。兔肉制品在近二十年來得到迅速發展，在世界范圍內越來越受歡迎，尤其是在中國[1]。但目前國內外對兔肉精深加工程度卻遠低于其他畜禽肉，這極大地阻礙了我國兔產業的普及與發展。ABDEL-NAEEM等[2]通過研究不同加工方式對兔肉的理化性質和營養價值的影響，發現烘箱烘烤是對兔肉加工最好的烹飪方法，因為它既有益于健康，又滿足消費者的需求。PEDRO等[3]以兔腿為原料，通過用KCl代替一定量的NaCl來研究如何提高干腌兔腿的營養，也為兔肉制品加工產業開辟新的道路。

醬鹵肉制品是通過加入香辛料等輔料制成的熟肉制品，承載了源遠流長的中國傳統文化特色，其不僅保留畜禽肉本身的營養特性，還通過醬鹵工藝賦予了肉制品濃香的滋氣味和紅亮的色澤，深受廣大消費者的青睞。目前，關于醬鹵肉制品的開發和研究大多集中于牛肉[4]、豬肉[5]等畜禽肉，而兔肉制品研究還相對缺乏。因此，開發出一種風味獨特、營養健康的新型鹵烤兔肉產品迫在眉睫。

本研究以自制的鹵烤兔肉丁為研究材料，通過頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜(headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)技術，定性定量分析鹵烤兔肉丁在加工過程中揮發性風味物質組分及含量，通過計算氣味活性值(odor activity value, OAV)，確定不同加工階段的主體風味物質和修飾風味物質，并運用主成分分析法對揮發性風味化合物的OAV值進行對比分析，確定不同加工過程中的主體風味物質，這對促進我國兔肉精深加工水平及規?；a具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從重慶阿興記良種選育基地挑選若干只70日齡的雄性伊拉兔子(2.5～2.8 kg/只)，按照國家畜禽屠宰加工衛生規范宰殺兔子，去除皮、頭、內臟后立即放入裝有冰袋的冷藏箱(6 ℃左右)運送到實驗室。4 ℃ 排酸處理24 h后，將兔背最長肌切成大小相同的顆粒狀(2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm)，分裝到塑封袋內(500 g/袋)，于-18 ℃環境下貯藏，試驗前12 h取出置于4 ℃氣候箱解凍待用。

試驗所需鹵料(八角、香葉、香奈、花椒、桂皮)，重百超市；2-甲基-3-庚酮(色譜純)，重慶躍翔化工有限公司。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2010Plus型氣相色譜-質譜聯用儀，日本SHIMADZU公司；CAR/PDMS型75 μm萃取纖維頭、57330-U型SPME手動進樣手柄，美國Supelco公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；FA114A型分析天平，上海豪晟科學儀器有限公司；DGG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；C21-KT2116E型多功能電磁爐，廣東美的生活電器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 工藝流程

樣品制備工藝流程如下：

原料兔肉處理→腌制→預煮→鹵制→烤制→二次調味→包裝→殺菌→成品

1.3.1.2 樣品處理

取提前解凍完全的兔肉??；采用濕腌法在4 ℃腌制24 h，每隔4 h翻動1次；將腌制后的兔丁進行預煮，保持沸水煮制20 min，并撇去浮沫；提前熬制好鹵水，水沸后，保持功率為1 000 W鹵制兔丁，60 min后撈出，放入烤盤；提前打開鼓風干燥箱，進行預熱，設置烘烤溫度為80 ℃。待溫度達到80 ℃且穩定時，放入鹵制好的兔丁，烤制40 min，每隔20 min翻動1次；將烤制后的兔丁放入鍋中，向鍋中加入芝麻、芝麻香油和花椒香油；待鹵烤兔肉丁冷卻至室溫，進行真空包裝；采用水浴巴氏殺菌(85 ℃，30 min)后得到成品。

1.3.2 氣相色譜質譜檢測條件

固相微萃取法條件參考DENG等[6]方法，略有修改。分別將新鮮兔肉、腌制、鹵制、烤制、二次調味，成品6組樣品用絞肉機絞碎，精確稱取3.5 g(精確到0.001 g)肉樣于20 mL頂空萃取瓶中，加入1 μL 0.816 mg/mL 2-甲基-3-庚酮，旋緊瓶蓋并旋渦振蕩使其混合均勻，在80 ℃條件下水浴平衡15 min，插入活化好的SPME萃取頭，在80 ℃水浴條件下萃取30 min，萃取完成后立即插入GC進樣口解析5 min。

氣相條件參照CHE等[7]的方法，略有修改。GC分析毛細管柱為DB-5MS(30 m×0.2 mm, 0.25 μm)，壓力為100.0 kPa；總流量為50.0 mL/min；柱流量為1.78 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣，不分流進樣。升溫程序為：起始溫度40 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min的速度升溫至120 ℃，最后以10 ℃/min 的速度升溫至230 ℃并保持5 min。

質譜條件參照CHE等[7]的方法，略有修改。電子電離源，電子能量為70 eV；接口溫度為230 ℃；離子源溫度為230 ℃；檢測器電壓為350 V；質量掃描范圍為30～500m/z，溶劑延遲為1 min。

1.3.3 揮發性物質的定性與定量

根據化合物保留時間，將質譜數據與計算機中MS定性譜庫(NISTO8.LIB與NISTO8S.LIB)進行檢索并匹配，僅選取相似度大于80的化合物定性為該物質。參考李娟等[8]的方法，略有修改。定量分析采用以2-甲基-3-庚酮作為內標，依據峰面積比計算各揮發性風味物質的含量(假定各揮發性成分的絕對校正因子為1.0)，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Cx為未知揮發性化合物含量，μg/kg；C0為內標化合物質量濃度，μg/μL；V0為內標化合物進樣體積，μL；Sx為未知揮發性化合物的峰面積；S0為添加的內標化合物峰面積；m為樣品質量，kg。

1.3.4 揮發性風味物質評價

根據內標法算出鹵烤兔中各揮發性風味物質的含量，查閱相應揮發性風味物質在水中的閾值。通常OAV值是評價揮發性風味物質對總體風味物質的貢獻大小，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：Ci為風味組分的濃度，μg/kg；Ti為相應風味組分的感官閾值，mg/kg。

當0.1≤OAV<1時，表明該揮發性風味物質只對總體風味物質起到輔導修飾的作用；當OAV≥1時，表明該風味組分對總體風味物質具有主體作用，對整體的風味起到較大的貢獻[9]。

1.3.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 26軟件對鹵烤兔中產生的揮發性風味物質的氣相色譜質譜數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 鹵烤兔丁揮發性物質分析

由表1可知，在鹵烤兔肉丁加工過程中共產生137種揮發性物質，其中鮮肉、腌制、鹵制、烤制、二次調味和成品這6個加工過程中分別檢出36、32、40、41、63和59種揮發性物質，含量依次為(675.28±0.09)、(332.11±0.38)、(582.08±0.27)、(457.51±0.41)、(986.47±0.45)、(722.27±0.11) μg/kg。鮮肉中的揮發性物質主要是醛類和酸類，分別占總質量濃度的38.29%和29.74%；腌制中的主要揮發性物質是醇類和醚類，分別占總質量濃度的78.48%和12.01%；鹵制過程中的主要揮發性物質是醇類和酸類，分別占總質量濃度的53.66%和15.32%；烤制過程中的主要揮發性物質是醇類和酸類，分別占總質量濃度的58.29%和16.61%；二次調味過程中的主要揮發性物質是醇類和烴類，分別占總質量濃度的54.82%和24.02%；成品中的主要揮發性物質是醇類和烴類，分別占總質量濃度的46.55%和19.80%。

表1 鹵烤兔肉丁中揮發性成分GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analysis of volatile flavor components in bittern roast rabbit diced meat

續表1

續表1

2.2 醇類揮發性風味物質含量分析

通過OAV對鹵烤兔肉丁加工過程中揮發性風味物質進行剖面分析，根據所得的OAV值確定風味物質的貢獻大小。醇類物質是肉制品中重要的揮發性風味物質，主要是由脂肪氧化還原過程產生。鹵烤兔肉丁的6個加工過程中存在大量的醇類物質，可能對鹵烤兔肉丁的風味有影響的主要有芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、1-辛烯-3-醇、桉葉油醇、苯乙醇、辛醇、正戊醇和異龍腦等醇類，起主體作用的是芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇和桉葉油醇。其中2-丙烯-1-硫醇含量最大(閾值為0.000 1 mg/kg)，通常硫醇類化合物是構成合成香料中重要的化合物，并且具有一定的蔥香和烤肉的香味，賦予肉制品較獨特的風味[12]。芳樟醇具有鈴蘭香味[8]，在加工過程中含量相對較高，其主要出現在鹵制、烤制、二次調味以及成品階段，對鹵兔肉丁的風味貢獻較大。1-辛烯-3-醇是亞油酸氧化產物中的一種，具有蘑菇香味[13]，其閾值較低，雖然含量較少，但是其對鹵烤兔肉丁的風味具有重要的修飾作用。在整個加工過程中醇類物質含量呈現先上升后下降的趨勢，醇類物質的主要來源是脂肪酸的氧化降解[9]，隨著加工過程的進行，脂肪酸氧化加劇，醇類物質逐漸增加，隨著實驗的進行，醇類會裂解為醛類或者酮類物質。

2.3 醛類揮發性風味物質含量分析

醛類物質是脂肪氧化的產物，對兔肉的風味物質產生較大的影響[14]。在加工過程中可能對鹵烤兔肉丁風味有影響的主要有4-異丙基苯甲醛、苯甲醛、癸醛、壬醛、異戊醛和己醛等醛類，起主體作用的主要是壬醛、異戊醛和己醛。己醛是脂質氧化的主要標志物[14]和兔肉腥味的主要來源[15]，低濃度的醛類物質具有較好的肉味，較高的含量會產生不好的味道。在鮮肉階段己醛含量為(252.80±0.01) μg/kg，腌制過后含量變為(1.94±0.02) μg/kg，可能是因為腌制過程中其他風味物質對其進行了掩埋或者消除；在烤制階段中，己醛含量增加了，可能是加工過程中脂肪氧化轉化為了己醛[15]。在二次調味和成品階段產生了較多的醛類，其中壬醛和異戊醛含量最高，且其閾值較低，對鹵烤兔肉丁的風味貢獻比較大，壬醛主要是由油酸氧化產生，具有烤焦的香味[16]，壬醛主要在后面2個加工階段產生，對風味有較大的貢獻。在整個加工過程中，醛類物質含量呈現先下降后上升的趨勢，醛類物質主要來源于脂肪的氧化分解，從腌制到成品階段，醛類物質含量逐漸增加，對風味的貢獻逐漸增大。

2.4 酯類揮發性風味物質含量分析

酯類主要也是脂肪氧化的產物，通?？梢酝ㄟ^酸和醇的酯化反應形成[6]。由于酯類的閾值較大，OAV值都小于0.1，只對風味物質起到一定的修飾作用。在鮮肉階段酯類含量較多，隨后酯類含量急劇下降，隨著之后的加工，酯類含量緩慢上升，主要原因是熱加工過程中醇醛之間相互作用，產生了一定的酯類物質。

2.5 烴類揮發性風味物質含量分析

烴類物質一般閾值比較大，對揮發性風味物質貢獻較少[17]。烴類物質在鮮肉階段主要是茴香烯，在二次調味階段和成品階段主要含有(+)-檸檬烯、茴香烯、和萜品油烯等。由表1可以看出，經過長時間的加工，烴類物質種類與含量都增加了，說明長時間加工會導致烴類的含量增加[18]。但是由于閾值比較高，所以對風味物質的貢獻比較小，其中茴香烯和叔丁基苯對鹵烤兔肉丁的風味具有一定的修飾作用，只有(+)-檸檬烯對鹵烤兔肉丁的風味起到主體作用。烴類物質主要來源于香辛調味料或脂肪酸的烷氧基裂解產生[8]，在進行二次調味時，烴類物質含量達到(236.93±0.18) μg/kg，隨著加熱的進行，在成品階段含量有所下降。

2.6 酚類、酮類和醚類揮發性風味物質含量分析

酚類物質大部分來源于香料中，有研究者發現酚類物質是一些香料植物的主要成分[19]，在加工過程中會轉移到產品中，從而增加產品的風味。在加工過程中草蒿腦的OAV值明顯超過1，可以說草蒿腦對鹵烤兔肉丁的風味起到重要的主體作用，草蒿腦是在鹵制階段后出現的，這也證實了草蒿腦主要來源于香辛料等物質中。隨著加工的進行，草蒿腦的含量逐漸增加，是鹵烤兔肉丁的主體風味之一。

酮類通常被認為是在脂質氧化、烷烴降解和仲醇脫氫過程中形成的副產物[6]，酮類化合物對肉味的形成有重大影響。酮類物質在性質上是穩定的并且具有持久的香氣，通常帶有花香。在6個加工過程只檢測出了甲基庚烯酮，其OAV值小于1，只對鹵烤兔肉丁的風味起到一定的修飾作用。在整個加工過程中，總酮類物質呈現先上升再下降的趨勢，前期由于脂質氧化或美拉德反應而產生，后期作為后續反應的底物而被消耗[11]。

絕大多數醚類化合物都可以產生令人愉悅的香氣[20]。在加工過程中，含量最多的醚類物質是甲醚，但是甲醚的閾值比較高，所以對風味的貢獻就比較低，二烯丙基硫醚和烯丙基二硫醚是香料物質成熟過程中產生的[21]，其閾值較低，所以對鹵烤兔肉丁的風味貢獻率較大，可以對風味起到主體作用。

2.7 其他揮發性風味物質含量分析

其他類主要是一些吡咯、吡嗪類物質。呋喃類物質一般具有強烈的肉味和極低的氣味閾值，呋喃也可能是煮熟的兔肉發出甜味和焦糖樣氣味的原因[18]，但是此次實驗中并沒有呋喃物質的出現。吡咯和吡嗪類物質主要是在二次調味和殺菌后成品階段出現，吡嗪類物質是通過含氮物質在美拉德反應中生成的[22]，一般會在加工后期出現，所以通過控制烤制和二次調味等加工過程有利于促進有益揮發性風味物質的生成和抑制不良物質生成。

2.8 鹵烤兔肉丁揮發性風味物質氣味活性值分析

OAV≥1的揮發性風味物質對總體風味物質起到主體作用，對鹵烤兔肉丁的風味起到較大的貢獻，往往OAV值越大，就對總風味物質的貢獻越大[23]。由表2可知，在鹵烤兔肉丁加工過程中鑒定出對風味物質起主體作用的物質共有10種，其中醇類3種，醛類3種，烴類1種，酚類1種，醚類2種。在鮮肉階段和腌制階段只有1種醛類的OAV值大于1，即己醛，這就證明兔肉在鮮肉階段的主體風味物質主要是腥味物質己醛，這與鄧大川[15]的研究相符。在鹵制階段有5種起主體作用的風味物質，分別為芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、己醛、草蒿腦、烯丙基二硫醚。在烤制階段有4種起主體作用的風味物質，分別為桉葉油醇、芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇和草蒿腦。在二次調味階段有6種起主體作用的風味物質，分別為芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、壬醛、己醛、(+)-檸檬烯、草蒿腦。在成品階段有8種起主體作用的風味物質，分別為芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、壬醛、異戊醛、己醛、(+)-檸檬烯、草蒿腦、二烯丙基硫醚。

在鹵制、烤制、二次調味以及成品階段均有芳樟醇(OAV范圍為4.78～85.13)、2-丙烯-1-硫醇(OAV范圍為1 301.35～2 807.58)和草蒿腦(OAV范圍為48.13～150.30)的存在，并且其相對含量還比較大，對風味起到主體作用。以上3種氣味活性物質的OAV較高，對鹵烤兔肉丁的風味起到顯著的貢獻作用，被認定為鹵烤兔肉丁的特征風味物質。一般在烤制加工過程中會伴隨著一定量的脂肪氧化以及美拉德反應的發生，會導致醛類和吡嗪類化合物大量產生，但是因為一些吡嗪類物質的閾值較大，所以對鹵烤兔肉丁的風味貢獻不大。

表2 鹵烤兔肉丁的主體風味物質(OAV≥1)Table 2 The main flavor substance of braised rabbit diced meat(OAV≥1)

2.9 鹵烤兔肉丁加工過程中揮發性風味物質的主成分分析

主成分分析主要就是用較少的主要成分去解釋原始數據中大部分情況，一般要求累積方差百分比達到85%[24]。對鹵烤兔肉丁的6個加工過程中的10種主體風味物質(OAV≥1)進行主成分分析，其中PC1、PC2、PC3、PC4的方差貢獻率分別為52.347%、18.958%、12.439%、11.779%，累積為95.523%，超過了85%，即這4個主成分能夠代表7種主體風味物質95.523%的綜合信息。鹵烤兔肉丁中各揮發性風味物質對主成分的影響主要通過載荷系數來表示，一般載荷系數的絕對值越接近1，則表明該物質對主成分的貢獻越大。所以，根據主成分分析可知，芳樟醇、壬醛、異戊醛、(+)-檸檬烯、草蒿腦和二烯丙基硫醚這6種風味物質在PC1中載荷系數較大，與PC1有較強的相關性；PC2與己醛和2-丙烯-1-硫醇這2種風味物質有較強的相關性；而PC3與桉葉油醇和烯丙基二硫醚這2種風味物質有較強的相關性。

如圖1所示，在不同的加工階段鹵烤兔肉丁的揮發性風味物質存在較大的差異，鮮肉和腌制2個階段都位于第三象限，與PC1和PC2呈負相關；鹵制和烤制2個階段都位于第二象限，與PC1呈負相關，與PC2呈正相關。結合圖1和圖2可知，己醛位于第三象限，且鮮肉和腌制階段也位于第一階段，也就可以說鮮肉和腌制階段中的主要揮發性風味物質就是己醛；桉葉油醇和烯丙基二硫醚位于第二象限，說明這些物質是鹵制和烤制階段中的主要揮發性風味物質；二次調味和成品分別位于第一象限和第四象限，芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、(+)-檸檬烯和草蒿腦也位于第一象限，也就是說這些物質是二次調味的主要揮發性物質；壬醛、異戊醛和二烯丙基硫醚位于第四象限，說明成品中主要的揮發性風味物質就是壬醛、異戊醛和二烯丙基硫醚。進行主成分分析可以發現，不同加工過程中揮發性風味物質存在明顯差異，不同加工過程中的風味物質能夠得到良好的分離。

圖1 不同加工過程中的PC1與PC2得分圖Fig.1 Scores of PC1 and PC2 in different processing processes注：1～6分別代表6個加工階段，即鮮肉、腌制、鹵制、烤制、二次調味、成品

圖2 鹵烤兔肉丁主成分的載荷圖Fig.2 Load diagram for principal component analysis of bittern roast rabbit diced meat注：V1～V10分別代表：桉葉油醇、芳樟醇、2-丙烯-1-硫醇、壬醛、異戊醛、己醛、(+)-檸檬烯、草蒿腦、二烯丙基硫醚、烯丙基二硫醚

3 結論

本研究主要采用了HS-SPME-GC-MS技術對鹵烤兔肉丁加工過程中關鍵過程的揮發性物質變化進行檢測分析，檢測出加工過程中共存在137種揮發性物質，其中鮮肉、腌制、鹵制、烤制、二次調味和成品中分別檢出36、32、40、41、63和59種種揮發性物質。對鹵烤兔肉丁中揮發性物質起主體作用的風味物質共10種，其中醛類3種、醇類3種、烴類1種、酚類1種、醚類2種。進行主成分分析發現，不同加工過程的揮發性風味物質存在差異，不同加工過程中起到作用的揮發性風味物質也存在差異。

本文以新開發的新型兔肉產品為研究材料進行研究，對兔肉產品的開發具有一定的參考意義，對未來兔肉制品行業有一定的進步性價值，但對加工過程中風味物質以及滋味物質的研究還不夠全面，未來可繼續在這方面進行研究。