槲皮素通過抑制TGF-β/TAK1/JNK和TGF-β/Smad2信號通路發揮抗肝纖維化的作用

王紹展，王媛媛，顧妍秋，陳春，李勝男，王蓉，原永芳（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院藥劑科，上海 201999）

肝纖維化是各種慢性刺激或病因所致肝組織中細胞外基質（ECM）的過度增生和沉積，是一種可逆性的肝損傷修復反應，繼續發展可導致肝硬化甚至肝癌。大量研究表明，肝星狀細胞的活化是肝纖維化發生的中心環節[1-2]，在促纖維化因子作用下，激活的肝星狀細胞急劇增殖并分泌大量ECM，膠原纖維的合成和分解失衡，導致肝組織ECM 過度沉積。目前尚無美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的特效的抗肝纖維化的化學或生物藥物進入臨床應用。槲皮素是一種黃酮類化合物（結構式見圖1），廣泛存在于蔬菜、水果、茶等植物的花、葉、果實中，具有抗氧化、抗炎、免疫調節、抑制新生血管生成等作用[3]。研究證實槲皮素對多種實驗性肝纖維化模型具有很好的保護作用[4-7]，對其抗肝纖維化作用機制NF-κB/IκBα、Wnt 等信號傳導通路方面進行了有益的探討[4-8]，但仍然不夠全面。研究發現TGF-β介導的TGF-β/Smad 通路和非Smad依賴通路（如TGF-β/TAK1/JNK 信號傳導通路）在肝星狀細胞的活化、增殖以及膠原合成的過程中發揮了非常重要的調控作用[9-12]。為探討槲皮素抗纖維化的作用機制與TGF-β/TAK1/JNK 和TGF-β/Smad2 信號通路之間的關聯，本研究構建了二甲基亞硝胺（DMN）誘導大鼠肝纖維化模型和TGF-β誘導HSC-T6 細胞活化模型，從體內和體外兩個方面，著重考察槲皮素對TGF-β/TAK1/JNK 和TGF-β/Smad2 信號通路的影響。

圖1 槲皮素的結構式Fig 1 Chemical structure of quercetin

1 材料

槲皮素（CAS：117-39-5，上海詩丹德生物技術有限公司，純度≥98%），DMN（Sigma），TAK1、Phospho-TAK1、JNK、Phospho-SAPK/JNK（美國Cell signaling Technology），Smad2、Phospho-Smad2 單克隆抗體、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）（美國Santa Cruz Biotechnology），轉化生長因子β1（TGF-β1）（美國R&D Systems），免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），大鼠肝功能檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），血清肝纖維化指標檢測試劑盒（鄭州安圖生物工程股份有限公司）。引物序列由上海生工工程技術服務有限公司合成；其他主要試劑均購自碧云天生物技術公司。

全自動生化分析儀（美國Beckman LX-2）；Nanodrop 2000 分光光度計（Thermo Fisher Scientific）；LightCycler 480儀器（Hoffman-La Roche）；奧德賽紅外探測及圖像成像分析系統（LI-COR Biotechnology，Nebraska）。

SPF 級雄性SD 大鼠40 只[6 周齡，180 ～220 g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬） 2013-0016]，飼養條件為標準動物實驗室：溫度25℃，濕度（55±10）%，12 h/12 h 明暗循環，給予標準的食物和水。

2 方法

2.1 大鼠分組及給藥

SPF 級雄性SD 大鼠40 只適應性飼養2 周后，將大鼠隨機分為正常組，DMN 模型組，槲皮素12.5 mg·kg-1組、25 mg·kg-1組和50 mg·kg-1組，每組8 只。除正常組腹腔注射相同劑量生理鹽水外，其余大鼠均腹腔注射1% DMN（10 mg·kg-1），每周3 次（每周前3日每日一次，連續注射3 次，后4日不給予注射），共4 周[13]。造模第3 周開始灌胃給予槲皮素治療，每日一次，治療2 周。在第4 周結束時，再次稱量大鼠體質量（空腹），并用5%水合氯醛麻醉，然后，從腹主動脈快速獲取新鮮血液樣本，3000 r·min-1、4℃離心10 min，-80℃下儲存。所有肝臟樣本獲取后迅速稱重，部分用4%多聚甲醛固定，進行組織病理學和免疫組化檢測。剩余的肝臟樣本液氮速凍后，在-80℃下冷凍保存。

2.2 肝功能、肝纖維化指標檢測

采用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）。采用肝纖維化系列檢測試劑盒測定透明質酸（HA）、血清Ⅲ型前膠原氨基末端前肽（PⅢNP）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）和層粘連蛋白（LN）的水平。采用羥脯氨酸檢測試劑盒檢測肝組織中羥脯氨酸的含量。

2.3 肝臟組織病理學觀察和免疫組化檢測

將4%多聚甲醛固定24 h 的肝組織標本，經脫水，石蠟包埋后，制成5 μm 厚的切片，再經脫蠟沖洗，用蘇木精伊紅（HE）染色、天狼星紅（Sirius）和Masson 三色染色方法進行切片染色，光學顯微鏡下觀察肝臟病理情況和膠原沉積的變化，并用Image pro-Plus 6.0 軟件計算肝組織中的膠原形成面積（膠原形成面積＝陽性染色面積/總面積×100%）。用抗α-SMA、p-TAK1、p-JNK、Smad2 的抗體進行免疫組化染色，黃色或棕褐色染色顯示陽性信號，根據陽性染色的程度和位置進行評估[14]。

2.4 肝組織mRNA 定量PCR 檢測

按QIAGEN 總RNA 提取試劑盒說明書，稱取約30 mg 肝組織，用TRIzol 試劑均質離心提取mRNA，Nanodrop 2000 分光光度計測定濃度。按照TaKaRa 逆轉錄及PCR 試劑盒說明書，在LightCycler 480 儀器上進行逆轉錄合成cDNA 并擴增。以β-actin為內參，用2-ΔΔCT公式對目的基因進行定量分析。引物序列及擴增產物長度如表1所示。

表1 mRNA 擴增的基因引物序列Tab 1 Geneprimer sequences for mRNA amplification

2.5 MTT 法檢測槲皮素對HSC-T6 細胞增殖的影響

對數生長期HSC-T6 細胞消化離心后，用10%血清的DMEM 培養基調成5×104個·mL-1的混懸液接種于96 孔板中，每孔100 μL，使細胞數為5000 個/孔，將細胞分為正常組、槲皮素6 個質量濃度梯度（2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1），每組3 個復孔，置于37℃、5%CO2培養箱培養24 h。待細胞貼壁后，正常對照組加100 μL 培養基，其余各組加相應的藥物100 μL，繼續培養24 h 后，每孔加入10 μL MTT 溶液（5 mg·mL-1），4 h 后棄去上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀在490 nm 處測各孔吸光度值（OD），將正常對照組的細胞活性設為100%，計算槲皮素各濃度處理組細胞活性，細胞活性（%）＝（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

2.6 定量PCR 檢測HSC-T6 細胞活化相關基因轉錄情況

對數生長期HSC-T6 細胞消化離心后，用無血清的DMEM 培養基調成5×104個·mL-1混懸液，接種于6 孔板中，每孔2 mL，置于37℃、5%CO2培養箱培養過夜；將細胞分為正常組、TGF-β1（2 ng·mL-1）組、TGF-β1+槲皮素（10、20、40 μmol·L-1）處理組；在TGF-β1 和槲皮素共同處理24 h 后，提取總RNA，按照TaKaRa 逆轉錄及PCR 試劑盒說明書，在LightCycler 480 儀器上進行逆轉錄合成cDNA 并擴增。以β-actin 為內參，用2-ΔΔCT公式對目的基因（α-SMA、CollagenⅠ、MMP-I、TIMP-1）進行定量分析。

2.7 Western blot 法檢測 HSC-T6 蛋白表達

取對數生長期 HSC-T6 細胞，按“2.6”項下方法處理并分組。槲皮素預處理24 h 后，加入TGF-β1 刺激30 min；提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，沸水浴變性15 min，取30 μg 蛋白上樣，待SDS-PAGE電泳分離后，轉移至PVDF 膜，用5% BSA 溶液4 ℃封閉3 h，加入一抗（1∶1000），4 ℃過夜；TBST 洗滌3 次，5 min/次，加入二抗（驢抗鼠Alexa Fluor 546 IgG 或驢抗兔Alexa Fluor 488 IgG），室溫孵育2 h。采用奧德賽紅外探測及圖像成像分析系統進行檢測，以GAPDH 為內參，計算目的條帶的灰度值[15]。

2.8 統計分析

使用SPSS 21.0 對數據進行分析，數據以平均值±標準差（SD）表示，統計分析方法采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 槲皮素對DMN 誘導的大鼠肝臟總體形態及肝質量的影響

DMN 造模期間大鼠體質量增長情況如圖2A所示，與正常組相比，DMN 模型組大鼠體質量增長顯著下降（P＜0.05），而槲皮素各給藥組的體質量增長情況好于DMN 模型組，尤其是25 和50 mg·kg-1治療組（P＜0.05）。造模結束時各組大鼠體質量如圖2B 所示，DMN 模型組大鼠體質量顯著低于正常組（P＜0.05）；而同模型組相比，槲皮素25 和50 mg·kg-1治療組能劑量依賴性地提高大鼠體質量（P＜0.05）。

圖2B 顯示，DMN 模型組大鼠的肝質量同正常組相比亦顯著下降（P＜0.05），而槲皮素25和50 mg·kg-1治療組大鼠的肝質量顯著高于模型組（P＜0.05），其中槲皮素50 mg·kg-1組的治療效果最優（P＜0.05）。

圖2 大鼠體質量和肝質量Fig 2 Body mass and liver mass

3.2 肝功能及血清肝纖維化的影響

槲皮素對肝功能指標TBIL、ALT 和AST 的影響如圖3A 所示。與正常組相比，DMN 模型組的ALT、AST 和TBIL 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，槲皮素組TBIL、AST 和ALT 的水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，說明槲皮素能顯著改善DMN 誘導的大鼠肝功能。

血清肝纖維化指標HA、PⅢNP、Ⅳ-C 和LN的水平如圖3B 所示。DMN 模型組這四項指標明顯高于正常組（P＜0.05），說明DMN 造模后，肝組織中膠原合成增加，發生了顯著的肝損傷和肝纖維化。而槲皮素各給藥組與模型組比較，四項指標含量均下降（P＜0.05），50 mg·kg-1下調效果最顯著（P＜0.05），25 mg·kg-1的治療效果也優于12.5 mg·kg-1（P＜0.05）。

圖3 槲皮素對大鼠肝功能（A）及血清肝纖維化（B）的影響Fig 3 Effect of quercetin on the liver function （A） and serum hepatic fibrosis （B）in rats

上述結果表明，槲皮素可有效減輕DMN誘導的大鼠肝損傷和肝纖維化，在12.5 ～50 mg·kg-1給藥劑量內，隨著給藥劑量增加，治療效果逐步提升。

3.3 槲皮素對DMN 誘導的大鼠肝臟組織病理學變化的影響

采用HE 染色觀察肝組織病理變化，采用Sirius 和Masson 染色觀察膠原沉積的情況，結果如圖4A 所示。從圖中可見，正常組肝組織中，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，肝小葉結構完整，沒有變性或壞死的肝細胞以及其他病理特征。DMN 模型組肝細胞周圍紊亂，膠原明顯沉積，形成寬窄不一的纖維間隔，包繞、分割肝小葉，小葉結構紊亂，匯管區擴大，小葉內出現壞死，出現大量炎性細胞浸潤。槲皮素各給藥組能不同程度地改善肝組織損傷，減少膠原生成，降低肝小葉被破壞的程度，尤其在50 mg·kg-1組，肝臟病變和炎性細胞浸潤明顯減少。

如圖4B 所示，與正常組相比，DMN 模型組膠原面積急劇擴大，羥脯氨酸含量顯著升高（P＜0.05），槲皮素25 和50 mg·kg-1治療2周后，能顯著抑制膠原的生成，降低羥脯氨酸的含量，且50 mg·kg-1的槲皮素治療效果優于25 mg·kg-1（P＜0.05）。

圖4 槲皮素對DMN 誘導大鼠肝組織的病理學變化及膠原合成的影響Fig 4 Effect of quercetin on the pathological changes and collagen synthesis of liver tissues in rats induced by DMN

3.4 槲皮素對纖維化肝組織中纖維化相關基因轉錄水平的影響

采用Real-time PCR 檢測肝組織中星狀細胞活化相關基因（α-SMA、E-cadherin、Snail），膠原合成相關基因（CollagenⅠ和CollagenⅢ），以及膠原降解相關基因（TIMP-1和MMP-1）的mRNA水平，結果如圖5所示。與正常組相比，DMN模型組大鼠肝組織中α-SMA、Snail、CollagenⅠ、CollagenⅢ和TIMP-1的mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）， 而MMP-1和E-cadherin的mRNA水平顯著下調（P＜0.05）；與DMN 模型組相比，槲皮素給藥組能顯著上調MMP-1和E-cadherin的mRNA 水平，并顯著抑制α-SMA、Snail、CollagenⅠ、CollagenⅢ和TIMP-1 的mRNA 水平，且效果呈劑量依賴性，50 mg·kg-1效果最顯著（P＜0.05）。

圖5 槲皮素抑制DMN 誘導大鼠肝組織的纖維化相關基因轉錄Fig 5 Quercetin inhibits the transcription of fibrosis related genes in rat liver induced by DMN

3.5 槲皮素對纖維化肝組織中α-SMA、p-TAK1、p-JNK、Smad2 蛋白表達的影響

免疫組織化學檢測結果如圖6所示。與正常組相比，DMN 模型組大鼠肝組織中α-SMA、p-TAK1、p-JNK、Smad2 蛋白表達水平明顯升高；槲皮素各給藥組肝組織中這些蛋白表達顯著降低，并且槲皮素25 和50 mg·kg-1組降低較明顯。

圖6 槲皮素對DMN 誘導的纖維化肝組織表達纖維化相關蛋白的調控作用Fig 6 Effect of quercetin on the expression of fibrosis related proteins in DMN induced fibrotic liver tissues

3.6 槲皮素對肝星狀細胞HSC-T6 增殖活性的影響

通過MTT 法檢測槲皮素對HSC-T6 細胞增殖活性的影響，結果如圖7所示。低于10 μmol·L-1的槲皮素處理24 h，對HSC-T6 細胞的增殖基本沒有影響；當槲皮素濃度升至20 μmol·L-1時，顯示出一定的抑制作用，細胞活性為84.07%（P＜0.05）；隨著濃度繼續上升，槲皮素對HSC-T6 細胞的增殖抑制作用越來越強，當濃度達到80 μmol·L-1時，細胞活性為70.5%（P＜0.01）。

圖7 槲皮素對HSC-T6 細胞增殖活性的抑制作用Fig 7 Inhibitory effect of quercetin on the proliferation of HSC-T6 cells

3.7 槲皮素對TGF-β1 刺激下HSC-T6 細胞肝纖維化相關基因轉錄水平的影響

通過Real-time PCR 評估槲皮素對HSC 活化標志物α-SMA基因，膠原合成與降解相關基因（CollagenⅠ、MMP-1、TIMP-1）的轉錄水平的影響，如圖8所示。與正常組比較，TGF-β1（2 ng·mL-1）刺激24 h，除MMP-1降低外，α-SMA、CollagenⅠ、TIMP-1的mRNA 水平均顯著升高（P＜0.05）；與TGF-β1 刺激組相比，槲皮素（10 ～40 μmol·L-1）處理24 h，能劑量依賴性地抑制這些基因的轉錄變化（P＜0.05）。

圖8 槲皮素對HSC-T6 細胞肝纖維化相關基因mRNA 水平的影響Fig 8 Effect of quercetin on the mRNA levels of fibrosis-related factors in HSC-T6 cells

3.8 槲皮素對TGF-β/TAK1/JNK 和TGF-β/Smad2信號傳導通路相關蛋白表達水平的影響

采用Western blot 法檢測TGF-β/TAK1/JNK 和TGF-β/Smad2 信號傳導通路相關蛋白在HSC-T6 細胞中的變化情況，結果如圖9所示。與正常組相比，TGF-β1（2 ng·mL-1）刺激30 min，能顯著地升高p-TAK1、p-JNK 和p-Smad2 水平（P＜0.05）；槲皮素（20、40 μmol·L-1）預處理24 h 能劑量依賴性地下調p-TAK1、p-JNK 和p-Smad2水平（P＜0.05）。

圖9 槲皮素對HSC-T6 細胞TGF-β/TAK1/JNK 和TGF-β/Smad2 信號通路的調控作用Fig 9 Regulation of quercetin on TGF-β/TAK1/JNK and TGF-β/Smad2 signal pathways in HSC-T6 cells

4 討論

肝纖維化是各種慢性肝損傷因素誘發的肝組織損傷修復反應，是各種慢性肝病向肝硬化進展的共同病理過程，由于肝纖維化具有可逆性特點，因此防治肝纖維化對于防治肝硬化具有重要的臨床意義[16]。

DMN 誘導的大鼠肝纖維化模型，是常用的實驗性肝纖維化動物模型[13，15]。本研究中發現槲皮素治療2 周，能劑量依賴性地下調DMN 誘導肝纖維化大鼠血清ALT、AST 和TBIL 水平，改善大鼠肝功能；同時有效抑制血清肝纖維化指標上升，降低肝組織中羥脯氨酸的含量；對肝組織切片進行HE、Sirius 和Masson 染色，結果同樣表明槲皮素可以有效抑制膠原生成，保護肝小葉的正常結構。這些結果說明槲皮素能有效緩解DMN誘導的大鼠肝損傷，降低膠原的沉積，阻遏肝纖維化的進程。

肝星狀細胞的活化并大量合成膠原蛋白是肝纖維化發生發展的中心環節[17]?；罨男菭罴毎涮卣餍员憩F為：高表達α-SMA、Snail和TIMP-1[18-20]，低表達E-cadherin和MMP-1[21-22]，并且大量合成Ⅰ、Ⅲ型膠原等[23]。本研究結果發現，槲皮素能劑量依賴性地下調肝星狀細胞中α-SMA、Snail、TIMP-1以及CollagenⅠ、CollagenⅢ的mRNA 水平，同時上調E-cadherin和MMP-1的mRNA 水平。這表明槲皮素能有效抑制肝星狀細胞的活化及合成膠原蛋白。

肝星狀細胞的活化機制與TGF-β介導的信號通路密切相關[24]。TGF-β首先在細胞表面與TGF-βⅡ型受體（TβRⅡ）結合后，募集并激活TGF-βⅠ型受體（TβRⅠ）；活化的TβRⅠ進而招募并磷酸化激活受體Smad2 和Smad3；然后激活的p-Smad2/3 與胞漿中的共同通路型 Smad4形成異源復合體，轉入胞核，調控肝星狀細胞活化相關靶基因的轉錄，此為典型的TGF-β信號通路[25-26]。同樣活化的TβRⅠ也可以激活非Smad 依賴的TAK1/JNK 信號傳導通路。TAKl 屬于MAPKKK 家族成員，活化后可以通過激活MAPKK4/7 而磷酸化JNK（p-JNK）[27]；JNK 是MAPK 家族的成員，活化的JNK（p-JNK）進一步激活其底物（包括c-Jun、ATF2、Elk1、p53、NFAT4 等），從而調控肝星狀細胞的活化和增殖，參與肝纖維化形成[28]。本研究發現槲皮素能顯著下調DMN 誘導肝纖維化模型大鼠肝組織中p-TAK1、p-JNK 以及Smad2 的水平；能劑量依賴性地下調p-TAK1、p-JNK 和p-Smad2 水平。這些結果充分說明，槲皮素能通過抑制TGF-β/Smad和TGF-β/TAK1/JNK 信號通路活化，從而抑制星狀細胞活化。

綜上，本研究證實槲皮素具有顯著的抗DMN誘導大鼠肝纖維化作用，通過抑制TGF-β/Smad和TGF-β/TAK1/JNK 信號通路的激活與傳導，來抑制肝星狀細胞的活化和增殖，最終逆轉肝纖維化進程。