布地奈德直腸用脂質體溫敏凝膠制備工藝的研究

楊東亮，馬瑞麗，趙宇郁，滕亮，馬桂芝*，高曉黎（. 新疆醫科大學第一附屬醫院藥學部，烏魯木齊80054；. 新疆醫科大學 藥學院，烏魯木齊 800；. 慶陽市中醫醫院藥劑科，甘肅 慶陽 745099）

潰瘍性結腸炎（UC）是結直腸的一種慢性免疫介導的炎癥性疾病[1]，病因尚不明確，且暫無法治愈，如果不及時治療，可導致黏膜損傷及結直腸癌等致命并發癥[2]。在全球范圍內，UC 的發病率呈上升趨勢[3]，近二十余年來，我國UC的就診人數快速增長[4]。UC 一般均以連續性分布的方式，從直腸向近端結腸擴展，在中國病變的主要部位為直腸、直-乙狀結腸、左側結腸。糖皮質激素是活動期UC 誘導緩解治療的重要藥物，臨床?？诜蜢o脈給予糖皮質激素，但全身用藥易出現藥物不良反應并存在諸多限制，且局部藥物濃度低[5]。布地奈德（budesonide，Bud）是第二代皮質類固醇類激素，具有局部抗炎作用強，全身不良反應少的優點，可有效緩解輕中度UC 患者的癥狀[6]。

目前，臨床常使用吸入用Bud 混懸劑灌腸[7]，但混懸劑幾乎沒有生物黏附性，在腸道保留時間短，且幾乎不溶于水、局部吸收差，影響療效。故本研究利用脂質體的特性增加藥物溶解度、提高黏膜滯留性能、升高靶部位濃度、減少藥物入血[8]；同時，利用溫敏凝膠常溫下為液態、體溫下為凝膠的特點，促進藥物的均勻分布、提高局部黏附性能，以對抗腸道的自蠕動[9-10]。本研究將Bud 制備成脂質體后再進一步制成脂質體溫敏凝膠，使其兼顧脂質體和溫敏凝膠的優勢：給藥前為液體狀態，到達給藥部位后均勻分布，后迅速相變為凝膠黏附于腸黏膜，進一步通過脂質體實現靶向作用，提高療效，降低不良反應。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；New Classic MS 分析天平（梅特勒-托利多公司，d ＝0.01 mg）；KQ5200DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Zetasizer Nano ZS 納米激光粒徑測定儀（英國馬爾文儀器有限公司）；PS-1000 磁力攪拌器（東京理化器械株式會社）；3-18KS 臺式高速冷凍離心機（SIGMA公司）；VCX500 超聲波細胞破碎儀（Sonics &Materials Inc）；TP-6 智能透皮試驗儀（天津市鑫洲科技有限公司）；PHSJ-3F 雷磁pH 計（上海儀電科學儀器有限公司）；NDJ-5S 數字式黏度計（上海菁海儀器有限公司）；Milli-Q 艾柯超純水儀（美國密理博公司）。

1.2 試藥

Bud 對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y13J7C9082，純度≥ 98%）；Bud 原料藥（山東泰華生物科技有限公司，批號：20190906，純度≥ 99%）；大豆磷脂（批號：SYSO-200401）、膽固醇（批號：B80859）（上海艾偉拓醫藥科技有限公司）；泊洛沙姆407、泊洛沙姆188（北京索萊寶科技有限公司）；羥丙基甲基纖維素（上海麥克林生化科技有限公司）；醋酸纖維素膜（孔徑：0.45 μm，尺寸：50 mm）（上海市新亞凈化器件廠）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 Bud 的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-水（72∶28）為流動相等度洗脫，檢測波長260 nm，進樣量10μL，流速1 mL·min-1，柱溫25℃。

2.1.2 溶液的配制 取Bud 對照品適量，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，即得質量濃度為196.4 μg·mL-1的對照品儲備液。精密移取對照品儲備液適量，用甲醇依次稀釋為0.38、0.77、1.53、3.07、6.14、12.28、24.55、49.1、98.2 μg·mL-1的系列對照品溶液。

分別取Bud 對照品溶液、Bud 脂質體、Bud脂質體溫敏凝膠1.0 mL，甲醇定容，超聲，以0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

制備不含Bud 的空白脂質體、空白脂質體溫敏凝膠，各取1.0 mL，甲醇定容，超聲，以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得陰性樣品溶液。

2.1.3 專屬性考察 取Bud 對照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μL，進樣分析，記錄色譜圖，結果見圖1，基質對Bud 測定無干擾[11]。

圖1 Bud 脂質體及Bud 脂質體溫敏凝膠的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of Bud liposomes and Bud liposome temperature sensitive gel

2.1.4 線性關系考察 測定系列對照品溶液，以峰面積（Y）對Bud 質量濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y＝1.59×104X+1.993×103（r＝0.9999）。結果表明，Bud 在0.38 ～98.2 μg·mL-1與峰面積線性關系良好。

2.1.5 方法學考察 取供試品溶液連續測定6 次，測得精密度RSD為0.30%。于常溫下供試品分別放置0、2、4、6、8、10、12 h，測得穩定性RSD為1.1%。平行制備6 份供試品溶液，測得重復性RSD為1.7%。精密量取已知濃度樣品9 份，加低、中、高濃度對照品溶液，測得平均加樣回收率在98.7%～100.2%，RSD均＜2.0%。

2.2 Bud 脂質體的制備

2.2.1 制備工藝優選指標 以包封率、載藥量和粒徑作為考察指標，綜合分析。結合層次分析法確定的權重系數，得到綜合評分Y＝包封率/包封率最大值×0.7306+載藥量/載藥量最大值×0.1884+粒徑最小值/粒徑×0.0810[11]。

2.2.2 Bud 脂質體的制備工藝 根據Bud 性質，采用逆向蒸發法制備Bud 脂質體。精密稱取Bud原料藥、膽固醇和大豆磷脂適量于250 mL 圓底燒瓶中，加入20 mL 氯仿超聲使其溶解，再按有機相與水相的體積比加入超純水，水浴超聲10 min形成穩定的W/O型乳液，40℃下減壓蒸發除去有機溶劑，加入超純水，繼續旋轉蒸發，于冰浴條件下超聲，即得Bud 脂質體，于3 ～5℃保存[12]。

2.2.3 Bud 脂質體制備工藝單因素的考察 測定各脂質體包封率、載藥量和粒徑，以綜合評分Y為指標，按“2.2.2”項下方法考察膜材比（3∶1、6∶1、9∶1、12∶1 和15∶1）、脂藥比（2∶1、6∶1、10∶1、14∶1 和18∶1）、有機相與水相比例（V有機/V水相為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 和6∶1）、乳化時間（6、8、10、12 和14 min）、孵育溫度（20、30、40、50 和60℃）、分散時間（10、15、20、25和30 s）等因素對Bud 脂質體綜合指標的影響。結果，在膜材比為9∶1、脂藥比為6∶1、V有機/V水相為4∶1、乳化時間12 min、孵育溫度50 ℃、分散時間15 s 時，所制脂質體包封率較高。

2.2.4 星點設計-效應面法優化制備工藝 在單因素試驗的基礎上，選取脂藥比和V有機/V水相兩個對指標影響較大的因素，設計二因素三水平的星點設計-效應面法優化Bud 脂質體制備工藝。因素水平見表1，以綜合評分Y為考察指標，按照星點設計-響應面法設計進行試驗見表2、圖2，方差分析結果見表3。

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

圖2 Bud 脂質體制備工藝優化的效應面圖Fig 2 Response surface for optimization of preparation process of budesonide liposomes

表1 星點設計-效應面法的因素水平表Tab 1 Factor and level of central composite design-response surface method

采用Design-Expert 10.0.7 軟件對表2數據進行擬合，得到綜合評分Y的回歸方程為Y＝0.8897 - 0.0854A+ 0.0527B- 5.9275AB-0.0874A2-0.0902B2，模型P＜0.01，與數據的擬合度好，誤差低，可用于進一步分析與檢測。通過Design-Expert 10.0.7 軟件對優選的制備工藝條件進行預測，A＝4.5∶1，B＝4.0∶1，Y的預測值為0.92。應用Design-Expert 10.0.7 軟件對優選的制備工藝條件進行預測，A＝4.5∶1，B＝4.0∶1，Y的預測值為0.92。結合實際操作條件，初步確定優選工藝參數為：脂藥比4.5∶1，V有機/V水相＝4.0∶1，按照優選參數，采用逆向蒸發法制備3 批Bud 脂質體。結果表明，3 批樣本的包封率為（82.15±0.34）%、載藥量為（12.71±0.34）%、粒徑為（273.8±3.4）nm、Y為（0.95±0.01），說明工藝穩定可行，重現性好。

表2 星點設計-效應面法的結果Tab 2 Central composite design-response surface method

2.3 Bud 脂質體溫敏凝膠的制備

采用冷溶法制備Bud 脂質體溫敏凝膠。精密稱取泊洛沙姆407（P407）、泊洛沙姆188（P188）和羥丙基甲基纖維素（HPMC）適量，在磁力攪拌下緩慢加入到一定量的脂質體中，攪拌均勻后，于4 ℃下靜置溶脹24 h，即得。

2.4 Bud 脂質體溫敏凝膠工藝優選指標

2.4.1 膠凝溫度 采用試管倒置法[13]測定膠凝溫度。試管中加2 mL 凝膠溶液，插入溫度計，置恒溫水浴鍋中，從25 ℃開始緩慢升溫，每隔0.2 ℃將試管傾斜180°以觀察溶液的流動情況。溶液不流動時的最低溫度即為膠凝溫度，重復3次取平均值。

2.4.2 累積釋放度的測定 采用Franz 擴散池對藥物的累積釋放度進行測定[14]。供給池和接收池間以半透膜隔離。向接收池中加入恒溫至37.5℃的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）釋放介質，將Franz 擴散池置于37.5℃恒溫水浴磁力攪拌器中。取Bud 脂質體溫敏凝膠1.0 mL，加入到供給池中，放置10 min，待凝膠膠凝后開始攪拌。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 各取樣0.4 mL，同時補充恒溫介質0.4 mL。按“2.1.1”項下方法測定Bud含量。

2.4.3 評價指標——綜合評分法 以膠凝溫度（Y1）和累積釋放度（Y2）的綜合評分（Y）為評價指標[15]，其中：

Y1＝膠凝溫度/32 ℃，Y1評分實行分段評分，即：當Y1≥1時，Y1評分＝1/Y1×80；當Y1＜1 時，Y1評分＝Y1×80；

Y2＝∣Q2h-20%∣+∣Q6h-50%∣+∣Q12h-80%∣，Y2評分＝Y2min/Y2×20；

Y＝Y1評分+Y2評分。Y值越大指標越好。其中，Q2h、Q6h、Q8h分別為2 h、6 h、8 h 后的累積釋放度；Y2min為Y2最小值。

2.5 單因素對處方用量的考察

2.5.1 P407 用量的考察 固定處方中其他用量，分別加入14%、16%、18%、20%、22%、24%的P407 制備Bud 脂質體溫敏凝膠，測定膠凝溫度分別為38.8、36.2、33.5、31.0、30.0、29.0℃。表明隨著P407 用量的增加，膠凝溫度逐漸降低，當P407 的用量小于16%時，溫敏凝膠在37℃仍未發生膠凝。

2.5.2 P188 用量的考察 固定處方中其他用量，分別加入1%、2%、3%、4%、5%、6%的P188制備Bud 脂質體溫敏凝膠，測定膠凝溫度分別為28.9、30.8、33.5、35.5、37.2、39.0℃。表明隨著P188 用量的增加，膠凝溫度逐漸增大，當P188 的用量大于5%時，溫敏凝膠在37.5℃仍未發生膠凝。

2.5.3 HPMC 用量的考察 固定處方中其他用量，分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的HPMC 制備Bud 脂質體溫敏凝膠，測定膠凝溫度分別為34.3、34.0、33.8、33.6、33.5℃。表明隨著HPMC 用量的增加，膠凝溫度逐漸減小，但減小的趨勢不顯著。

2.6 正交試驗優選溫敏凝膠的處方組成

根據單因素試驗，確定各因素的水平，以“2.4.3”項下Y為綜合評價指標，進行L16（45）正交試驗，因素水平見表4，正交試驗結果見表5，方差分析見表6。

表4 正交試驗設計的因素水平(%)Tab 4 Factor and level of orthogonal test (%)

由表5及表6中可知，處方中各因素對Bud脂質體溫敏凝膠質量的影響程度依次為AB ＞A ＞C ＞B，優選水平組合為A3B3C1，即優選處方為P407 用量20%、P188 用量4%、HPMC 用量0.4%。

表5 正交試驗設計與結果Tab 5 Orthogonal test

表6 方差分析Tab 6 Variance analysis

2.7 最佳工藝的驗證

按優化的最佳工藝條件平行制備3 批樣品，平均膠凝溫度為（33.1±0.1）℃；平均體外累積釋放度Q2h（13.6±0.2）%、Q6h（41.6±0.4）%、Q12h（72.6±1.1）%；平均綜合評分（90.12±0.43）；分別用超純水將3 批樣本稀釋10 倍，置于NDJ-5S數字式粘度計樣品池中，通過Zetasizer Nano ZS納米激光粒徑測定儀對其粒徑和Zeta 電位進行測定，每個樣平行測3 次。分別用超純水將3 批樣本稀釋10 倍，置于NDJ-5S 數字式粘度計樣品池中，通過Zetasizer Nano ZS 納米激光粒徑測定儀對其粒徑和Zeta 電位進行測定，每個樣平行測3次。平均粒徑為（285.2±6.7）nm，平均Zeta 電位為-（45.8±5.3）mV，分布見圖3。制備的脂質體的平均粒經和平均Zeta 電位分別為（273.8±3.4）nm 和-（31.9±2.16）mV，可知制成脂質體溫敏凝膠后粒徑和Zeta 電位絕對值有增大的趨勢，但影響不明顯。經驗證該Bud 脂質體溫敏凝膠在體溫條件下能迅速膠凝，且累積釋藥性能良好。

圖3 Bud 脂質體溫敏凝膠的粒徑（A）和 Zeta 電位分布（B）Fig 3 Particle size（A）and Zeta potential distribution（B）of Bud liposome temperature sensitive gel

2.8 穩定性初步考察

按最佳處方工藝制備Bud 脂質體溫敏凝膠，置密閉西林瓶中，于4℃冰箱避光保存，分別于第0、15、30、45、60日取樣，觀察外觀性狀，測定膠凝溫度及藥物含量。結果表明在考察的時間范圍內，Bud 脂質體溫敏凝膠外觀、膠凝溫度、含量、粒徑和Zeta 電位無明顯變化，可滿足后續藥效學和藥動學的研究要求。

3 討論

Bud 為親脂性藥物，幾乎不溶于水，難以有效分散于水溶性凝膠中，故將其包裹于脂質體，以有效分散于溫敏凝膠中，從而發揮緩釋、局部靶向作用[16]。Bud 脂質體溫敏凝膠，在常溫下為自由流動的液體，在灌腸后可快速均勻分布于降結腸、乙狀結腸、直腸，后在體溫調節下迅速膠凝，黏度升高以對抗腸道自蠕動。另外，脂質體還可提高局部黏膜的滯留量，減少全身作用[8]。包封率、載藥量、粒徑、分散指數、電位等均為評價脂質體制備工藝的指標，一方面指標過多容易導致試驗難度增加；另一方面，預試驗中各考察因素對分散指數和電位并無顯著影響，故選擇包封率、載藥量和粒徑為指標，采用加權后綜合評分進行全面評價，不僅能全面反映各檢測指標對脂質體的重要程度，也能直觀反映整體制備工藝[11]。

膠凝溫度是溫敏凝膠的一個重要指標，溫敏凝膠灌腸后，若在病灶部位短時間內不能相變，會因腸道自蠕動作用而漏出，且凝膠所載藥物會發生突釋，降低制劑的緩釋作用，因此選擇膠凝溫度在30 ～34℃為宜[16]。為保證該直腸給藥系統在室溫下為液態，便于給藥和分布，進入直腸后迅速的膠凝，本研究以32℃為膠凝溫度的參考溫度[17]。然而，制劑質量的好壞不只取決于膠凝溫度，還與合適溫度下藥物能否充分釋放有關。故本研究在單因素篩選出各基質的合理范圍后，繼以膠凝溫度和累積釋放度的綜合評分為指標，使優選出的Bud 脂質體溫敏凝膠在生理溫度下迅速膠凝，發揮良好的釋藥作用。

在篩選處方時，P407 的質量分數影響最為顯著，這與P407 在處方中的作用與貢獻是一致的。泊洛沙姆分子是排列整齊的Z 字形結構。當溫度升高時，Z 字形結構可能轉變為纏繞緊密的折疊結構，而且纏繞越來越緊密，形成更黏稠的凝膠[18]。P407 是由聚氧乙烯（PEO）、聚氧丙烯（PPO）組成的PEO-PPO-PEO 非離子型三嵌段共聚物，其中PEO 與PPO 的質量比為7∶3。加入P188 后，相對增加了PEO 的比例而降低了PPO的比例，升高了體系的膠凝溫度。但P188 的用量過大時，本身已膠束化的P188 分子亦可參與凝膠構成，又導致體系膠凝溫度降低。因此要調節P407 的膠凝溫度需選擇P188 合適的用量[19]。本研究還發現P407 與P188 存在較為顯著的交互作用，其對指標的影響甚至大于P407 與P188 各自的影響。

雖然本研究對該直腸定向給藥制劑進行了初步研究，但對于其生物有效性、安全性尚待進一步研究，以期為UC 患者提供可靠的藥物制劑。