菟絲子不同炮制品指紋圖譜及多指標成分定量研究

李國衛，孫冬梅，胡綺萍，索彩仙，何嘉瑩，童培珍，陳向東，曹斯瓊（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244）

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br. 或菟絲子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟種子[1]，其性味甘、溫，歸肝、腎、脾經，為常用補益中藥。文獻研究表明，菟絲子含有金絲桃苷、槲皮素、異槲皮苷等黃酮類化學成分，具有改善心肌缺血、調節機體免疫等多種功效[2-5]。傳統中醫認為菟絲子生品可養肝明目，多用于目暗不明；菟絲子經鹽制后可以引藥入腎，能增強補腎固澀作用，常用于陽痿、遺精、胎動不安等。

菟絲子臨床使用的飲片有菟絲子、鹽菟絲子、炒菟絲子，其中菟絲子、鹽菟絲子為2020年版《中國藥典》收載品種，炒菟絲子為地方習用炮制品?，F菟絲子的文獻研究大部分集中在藥材的化學成分和質量控制、真偽鑒別等方面[6-9]，缺乏對生品及炮制品的系統研究。本研究以菟絲子生品和鹽菟絲子、炒菟絲子兩種炮制品進行比較研究，通過36 批樣品建立了菟絲子藥材的超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，結合相似度、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）探討影響菟絲子藥材和炮制品的差異成分，同時建立了菟絲子藥材中8 個指標性成分的含量測定方法，以期控制菟絲子及其炮制品的質量。

1 儀器與材料

Waters H-Class 超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent SB 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；XP-26 型百萬分之一天平、ME204E 型萬分之一天平（瑞士Mettler 公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（Merk）；水為純化水；其余試劑為分析純。

綠原酸（批號：110753-202018， 含量：96.10%）、金絲桃苷（批號：111521-201809，含量：94.90%）、異槲皮苷（批號：111809-201403，含量：92.90%）、槲皮素（批號：100081-201509，含量：96.80%）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；紫云英苷（批號：wkq17032404）、異綠原酸A（批號：wkq20020403）、新綠原酸（批號：wkq18030107）（對照品，含量均為98%，四川省維克奇生物科技有限公司）；隱綠原酸對照品（批號：DSTDY003501，含量：98%，成都德斯特生物技術有限公司）。所用藥材經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australisR.Br.的干燥成熟種子，見表1。

表1 藥材信息來源Tab 1 Source of samples

2 方法與結果

2.1 樣品炮制

2.1.1 炒菟絲子 《山東省中藥飲片炮制規范》2012年版[10]：“取凈菟絲子置熱鍋內，文火炒至微黃，有香氣逸出時，取出，放涼”。

2.1.2 鹽菟絲子 《中國藥典》2020年版[1]：“取凈菟絲子，照鹽炙法（加鹽水拌勻，悶透，置炒制容器內，文火加熱，炒至微鼓起，取出，放涼）?！?/p>

2.2 色譜條件

以Agilent SB 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱；以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0 ～9 min，7%→11%A；9 ～15 min，11%→14%A；15 ～20 min，14%A；20 ～25 min，14%→25%A；25 ～30 min，25%→27%A；30 ～35 min，27%→93%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為40℃；檢測波長為360 nm。

2.3 混合對照品溶液制備

取新綠原酸、金絲桃苷、綠原酸、異槲皮苷、隱綠原酸、異綠原酸A、紫云英苷和槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度分別為161.112、604.668、200.753、62.798、130.6536、210.834、60.449、100.128 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液制備

取樣品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇50 mL，加熱回流30 min，放冷，補重，搖勻，過濾，即得。

2.5 指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續進樣6 次，以金絲桃苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜2.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，以金絲桃苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜2.0%，表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.5.3 重復性試驗 取樣品粉末約0.5 g，平行6份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，以金絲桃苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜2.0%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 指紋圖譜的生成 取36 批樣品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，分別記錄UPLC 特征圖譜。采用指紋圖譜相似度軟件進行結果分析，菟絲子共確定10 個共有峰（見圖1），炒菟絲子和鹽菟絲子共確定12 個共有峰（見圖2～3），其中峰11、峰12 為炮制后產生。5 號峰（金絲桃苷）分離度好，峰形對稱，2020年版《中國藥典》規定其為評價菟絲子質量的指標性成分，故以5 號峰（金絲桃苷）為參照峰（即為S 峰）。

圖1 12批菟絲子UPLC 指紋圖譜共有峰Fig 1 Common peaks in the UPLC fingerprints of 12 batches of Cuscuta australis R.Br.

圖2 12批炒菟絲子UPLC 指紋圖譜共有峰Fig 2 Common peaks in the UPLC fingerprints of 12 batches of friedprocessed Cuscuta australis R.Br.

2.5.5 色譜峰指認 通過各對照品保留時間和紫外吸收光譜對共有峰的化學成分進行歸屬，指認了其中8 個特征峰，分別為峰2 綠原酸（最大吸收波長325 nm），峰5（S）金絲桃苷（最大吸收波長254 nm），峰6 異槲皮苷（最大吸收波長255 nm），峰7 紫云英苷（最大吸收波長264 nm），峰8 異綠原酸A（最大吸收波長327 nm），峰10槲皮素（最大吸收波長254 nm），峰11 新綠原酸（最大吸收波長325 nm），峰12 隱綠原酸（最大吸收波長323 nm）。結果見圖4。

圖4 菟絲子及其炮制品UPLC 色譜圖Fig 4 UPLC chromatograms of Cuscuta australis R.Br. and its processed product

2.5.6 相似度評價 采用指紋圖譜相似度軟件對36 批樣品進行相似度評價，結果見表2。說明同一工藝的樣品之間相似度較高，炮制工藝較為穩定。

2.6 多元統計分析

為研究菟絲子炮制前后指紋圖譜中總體化學成分的變化，統計36 批樣本中12 個色譜峰的峰面積，并將其除以每個樣品的稱樣量，以消除稱樣量差異造成的影響[11]。

2.6.1 PCA 將36 批樣品的色譜峰峰面積數據導入SIMCA 14.1 軟件進行分析。提取到兩個主成分，累積貢獻率達到70.50%，見表3。提取前兩個主成分做得分圖，見圖5。36 批樣品得到了較好的劃分，第一類（T1 ～T12）為菟絲子，主要分布在第一、四象限，第二類（CT1 ～CT12）為炒菟絲子，主要集中在第二、三象限，第三類（YT1 ～YT12）為鹽菟絲子，在第一、二、三象限中均有分布，其中YT6 散落在第四象限。PCA結果表明菟絲子生品與炮制品能較好區分，但兩種炮制品分布較為集中，為更好地考察化學計量學方法能否將菟絲子及兩種炮制品完全區分，進一步采用OPLS-DA 法對樣品進行分析。

圖5 主成分得分分布圖Fig 5 Principal component score distribution

表3 特征根、各主成分的貢獻率Tab 3 Contribution rates of characteristic roots and principal components

圖3 12批鹽菟絲子UPLC 指紋圖譜共有峰Fig 3 Common peaks in UPLC fingerprint of 12 batches of saltprocessed Cuscuta australis R.Br.

表236 批樣品相似度評價結果Tab 2 Similarity evaluation of 36 batches of samples

2.6.2 OPLS-DA 將36 批樣品數據導入SIMCA-P 14.0 軟件進行分析，建立3 組OPLS-DA 模型，見圖6。結果顯示，菟絲子與炒菟絲子、菟絲子與鹽菟絲子、炒菟絲子與鹽菟絲子的R2X分別為：0.970、0.912、0.964，R2Y分別為：0.924、0.938、0.842，說明建立的3 組模型能有效解釋3 種菟絲子之間的差異；Q2分別為0.569、0.890、0.522，說明模型具有一定的預測能力。通過提取OPLS-DA 模型中12 個變量的VIP 值圖（見圖7），對12個色譜峰峰面積VIP 值大小進行排列，結果顯示F12、F11、F1、F4 的VIP 值均大于1，其中F12為隱綠原酸，F11 為新綠原酸，F1 和F4 為未知成分，有待進一步指認。上述結果說明以上4 種化學成分對菟絲子生品與炮制品分類具有顯著的影響，是區分生品與炮制品質量差異的主要標志物。

圖6 OPLS-DA 得分圖Fig 6 Chart of OPLS-DA score

圖7 12個化學成分的VIP 值Fig 7 VIP values of 12 chemical components

2.7 多指標含量測定

文獻研究發現，菟絲子主要藥效成分除常見的黃酮類化合物外，還有酚酸類等化合物[12-13]，具有多種功效，如保肝、抗衰老、抗氧化、免疫調節等作用[14]，在進行指紋圖譜研究的同時，選擇黃酮類成分中的金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素，以及具備抗炎作用的酚酸類物質綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸A 作為菟絲子的質量控制指標，為菟絲子藥材和不同炮制品的質量評價提供參考。

2.7.1 系統適用性考察 取“2.3”項下混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果新綠原酸、異槲皮苷、綠原酸、紫云英苷、隱綠原酸、金絲桃苷、異綠原酸A 和槲皮素與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在1.00 ～1.05。

2.7.2 線性關系考察 取“2.3”項下混合對照品溶液，加甲醇稀釋制得6 個不同質量濃度的對照品溶液，以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X）進行線性回歸，結果各個對照品的線性關系良好，見表4。

表4 回歸方程及線性范圍Tab 4 Regression equation and linearity

2.7.3 精密度試驗 取“2.3”項下混合對照品溶液，連續進樣6 次，8 個成分的峰面積RSD分別為1.1%、0.98%、0.81%、1.1%、1.2%、1.2%、0.87%、1.1%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.7.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，記錄峰面積。8 個成分的峰面積RSD分別為1.0%、1.1%、0.78%、0.98%、1.3%、1.2%、1.3%、1.8%（n＝6），表明供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.7.5 重復性試驗 取樣品約0.5 g，平行6 份，按“2.4”項下方法制備成供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算含量。結果8 個成分的含量RSD分別為0.87%、0.98%、1.0%、1.3%、1.4%、1.0%、1.9%、1.2%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.7.6 加樣回收率考察 精密稱取已知含量的炒菟絲子（CT10）0.25 g，平行6 份，加入與樣品中含量等量的對照品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、異綠原酸A、槲皮素平均加樣回收率分別為95.52%、94.11%、97.24%、93.41%、93.90%、93.88%、93.92%、96.56%，RSD分別為1.5%、0.94%、1.2%、0.47%、2.3%、2.8%、1.3%、1.7%，符合方法學要求。

2.7.7 含量測定結果 精密稱取36 批樣品，按“2.4”項下方法制備成供試品溶液，進樣測定，結果見表5。菟絲子生品及兩種炮制品的8 個成分含量存在差異，RSD值在24.9%～92.6%。

表5 含量測定結果(mg·g-1)Tab 5 Content determination (mg·g-1)

2.7.8 方差分析 以上述8 個含量測定指標為檢驗變量，菟絲子、炒菟絲子和鹽菟絲子作為分組變量，通過Shapiro-Wilk 檢驗法對36 批藥材樣品的8 個成分數據進行正態分布驗證，結果顯示金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷和異綠原酸A 的sig.值小于0.05，不服從正態分布，故采用非參數檢驗法（秩和檢驗）進行分析。對菟絲子生品和兩種炮制品的8 個指標進行兩兩比較（Kruskal-Wallis 法）。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸和槲皮素在菟絲子和炒菟絲子以及菟絲子和鹽菟絲子間均有顯著差異（P＜0.05），而在炒菟絲子和鹽菟絲子間則無顯著差異；金絲桃苷在菟絲子和炒菟絲子間具有顯著差異（P＜0.05）。上述結果說明菟絲子生品和炮制品含量存在一定差異。

3 分析與討論

3.1 指紋圖譜及多元統計結果分析

菟絲子經加熱炮制后特征峰F11、F12、F1和F4 產生了變化，其中，F11 和F12 為菟絲子炮制后產生的特有峰，經指認分別為新綠原酸和隱綠原酸，可作為區分菟絲子生品和炮制品的特征成分，而炒菟絲子與鹽菟絲子的指紋圖譜則無明顯差異，表明菟絲子生品與炮制品存在一定差異，建立的方法可對其進行區分。

3.2 多指標含量結果分析

新綠原酸和隱綠原酸為炒菟絲子和鹽菟絲子的特征峰，綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷和異綠原酸A 在三者中的含量大小排序為：菟絲子＞鹽菟絲子＞炒菟絲子，而槲皮素則在炒菟絲子中占比最高，其次為鹽菟絲子、菟絲子。文獻研究表明，綠原酸在加熱情況下，容易生成新綠原酸和隱綠原酸[15]，這可能是導致炒菟絲子和鹽菟絲子中綠原酸含量降低的主要原因。加熱炮制亦對金絲桃苷含量有顯著影響，炮制溫度和時間是關鍵因素[16]。菟絲子經炒黃、鹽炙后槲皮素增加，可能是由于以槲皮素為苷元的黃酮苷類受熱易分解生成槲皮素所致[17]。定量分析結果顯示，菟絲子生品與炮制品在化學成分的含量上存在較大的差異，這與肖嵐等[18]的研究結果一致。

3.3 炮制品間差異分析

在含量測定的8 個成分中，兩種炮制品間的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷以及異綠原酸A 含量數據差異較小，而槲皮素含量則相差一半。鹽菟絲子炮制方法比炒菟絲子多了鹽水悶潤這個環節，炮制受熱溫度會存在一定差異，猜測這是導致兩者間槲皮素含量存在差異的主要原因。本研究結果表明炒菟絲子與鹽菟絲子在槲皮素成分上存在較大差異。

本研究從定性和定量兩個方面對菟絲子、炒菟絲子和鹽菟絲子進行了質量評價，通過多元統計分析手段研究菟絲子炮制前后指紋圖譜中特征成分的變化，明確區分炮制前后的特征峰，并測定了8 個主要藥效成分的含量，為優選菟絲子炮制工藝提供參考。