基于高效液相色譜指紋圖譜的天麻飲片-標準湯劑-配方顆粒對比研究

王轍遠，張璠璠，王隆隆，楊忠杰，陳恒文，于曉濤，王瑞*（. 漯河市中心醫院，河南 漯河 46300；. 中國中醫科學院廣安門醫院，北京 00000）

天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡的功效[1]。天麻最早記載于《神農本草經》，歷代本草學都把天麻列為“上品”，素有“補益上藥，天麻第一”的美譽[2]。研究表明天麻化學成分復雜，主要為天麻素、天麻苷元及其他的酚類、有機酸類、甾醇糖類和氨基酸，對循環、神經、骨骼、消化、內分泌、泌尿系統等病癥均有潛在的治療作用[3-5]。

標準湯劑（standard decoction，SD）是指以中醫理論為指導、臨床應用為基礎，參考現代提取方法，標準化工藝制備而成的單味飲片水煎劑[6]。標準湯劑是中藥研發質量控制及提升的重要舉措[7]。中藥配方顆粒（Chinese medicine formula granules，CFG）是指運用現代技術以單味中藥為基礎進行提取、濃縮、制粒、分裝等工藝制成的一種粉末或顆粒狀制劑[8-9]。中藥配方顆粒保留了傳統中藥復方臨證加減的特點，又具有免煎煮、易攜帶等優勢，促進了中藥劑型創新的進程，由于缺少科學統一的質量控制標準，導致中藥配方顆粒質量良莠不齊[10]。

目前，關于天麻的研究較多，但多集中在單獨藥材、化學成分或配方顆粒等的研究，沒有以天麻飲片（gastrodia pieces，GP）、標準湯劑、配方顆粒三者為基礎進行的HPLC 指紋圖譜相關性和差異性的研究[11-13]。

本研究采用HPLC 法建立天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒的指紋圖譜，同時測定多指標成分含量，比較三者間化學成分種類和量的差異，揭示三者間聯系，為天麻配方顆粒的臨床應用和研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；YRE-2000B 型旋轉蒸發儀（河南省予華儀器有限公司）；SB25-12D 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；FW-80 型微型高速萬能試樣粉碎機（天津市工興電器廠）；AUW-120D 型十萬分之一電子天平（日本SHIMADZU公司）；Milli-Q 超純水機（美國Millipore 公司）；5810R 高速離心機（美國Eppendorf 公司）。

1.2 樣品

12 批天麻飲片均購買于漯河市4 家醫院及2家藥店，經河南中醫藥大學苗明三教授鑒定均為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖。12批天麻配方顆粒購買于漯河市4 家醫院和鄭州市2 家醫院，詳情見表1。

表1 天麻飲片與配方顆粒信息Tab 1 Gastrodia pieces and formula granule information

1.3 試藥

天麻素（批號：DST190922-062， 純度：99.58%）、對羥基苯甲醇（批號：DSTDD012301，純度：99.99%）、巴利森苷A（批號：DSTDB-010201，純度：98.39%）、巴利森苷B（批號：DSTDB006401，純度：98.87%）、巴利森苷C（批號：DSTDB006501，純度：99.9%）、巴利森苷E（批號：DSTDB006601，純度：98.67%）（對照品，成都德思特生物科技有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher 公司），磷酸（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；水為飲用水或超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent 1260 高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0 ～10 min，5%B；10 ～25 min，5% ～40%B；25 ～30 min，40%B；30 ～31 min，40%～5%B；31 ～36 min，5%B）；進樣量10 μL；流速1 mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長220 nm[11-12]。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 取天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 對照品適量，加甲醇分別制成質量濃度為1.96、2.01、2.18、3.11、2.88、1.99 mg·mL-1的儲備液；精密量取上述各儲備液適量，混勻，制得含天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 分別為490.39、138.06、122.94、120.56、110.71、154.79 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 參考《中國藥典》2020年版一部方法，取12 批天麻飲片各10 g，加100 mL 50%甲醇，超聲30 min，補足稱重，靜置，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，得12 批天麻飲片供試品（GP1 ～GP12）[1]。

取12 批天麻飲片各20 g，置于250 mL 圓底燒瓶中，加水180 mL，充分浸潤30 min，加熱回流30 min，趁熱過濾，收集濾液，藥渣加水140 mL，回流20 min，趁熱過濾；濾液合并，降壓濃縮至200 mL，靜置，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，得12 批天麻標準湯劑供試品（SD1 ～SD12）[11]。

取相當于10 g 天麻飲片的配方顆粒樣品，加熱水（80 ℃）100 mL，使完全溶解，靜置，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，得12 批配方顆粒供試品（A 廠：CFG1 ～CFG3、B 廠：CFG4 ～CFG6、C 廠：CFG7 ～CFG9、D 廠：CFG10 ～CFG12）[14-15]。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系考察 精密取“2.2.1”項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋成系列混合對照品溶液，進樣分析。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），得線性回歸方程、線性范圍及相關系數，結果見表2。

表2 各化學成分的回歸方程、相關系數和線性范圍Tab 2 Regression equation，correlation coefficient and linearity

2.3.2 精密度試驗 取GP1 供試品溶液，連續進樣6 次，以巴利森苷E 為參照峰，計算得各主要共有特征峰相對保留時間的RSD均≤1.0%，相對峰面積RSD均≤1.6%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取GP1 樣品，平行制備6 份供試品溶液，進樣測定，以巴利森苷E 為參照峰，計算得各主要共有特征峰相對保留時間的RSD均≤0.9%，相對峰面積RSD均≤1.2%，表明方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取GP1 供試品溶液，分別在0、3、9、24、48 h 測定，以巴利森苷E 為參照峰，計算得各主要共有特征峰相對保留時間的RSD均≤1.0%，相對峰面積的RSD均≤1.2%，表明供試品在48 h 內穩定。

2.3.5 加樣回收試驗 取已知含量的GP1 樣品9 份，精密加入各成分質量分數的50%、100%、150%的混合對照品溶液，混勻，制備供試品溶液，進樣分析。結果6 種成分平均回收率均在98.08%～102.0%，RSD均小于2.0%，表明方法準確度良好。

2.4 指紋圖譜研究

取“2.2.2”項下飲片、標準湯劑及配方顆粒供試品各12 批，進樣分析，記錄色譜圖，建立天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒的指紋圖譜。結果飲片供試品相似度均超過了0.963，共標定13個共有峰；標準湯劑供試品相似度均大于0.978，共標定12 個共有峰，其中相對于飲片樣品缺少了峰2；配方顆粒供試品相似度均大于0.899，共標定12 個共有峰，其中相對于飲片樣品，缺少了峰2、峰8，增加了峰14（見圖1）。

圖1 天麻指紋圖譜結果Fig 1 Fingerprint of gastrodia

2.5 化學成分指認

取混合對照品溶液、供試品（GP1）適量，進樣分析，記錄色譜圖。根據化學對照品色譜、供試品溶液色譜比較，共指認6 個色譜峰，分別為峰6（天麻素）、峰7（對羥基苯甲醇）、峰9（巴利森苷E）、峰11（巴利森苷B）、峰12（巴利森苷C）、峰13（巴利森苷A），見圖2。

圖2 化學成分指認圖Fig 2 Chemical composition identification

2.6 樣品含量測定

按“2.1”項下色譜條件，同時測定天麻飲片、標準湯劑、配方顆粒供試品中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A 的含量。以12 批GP 樣品中各成分質量分數均值為基準1，計算天麻飲片、標準湯劑、配方顆粒中各成分質量分數的相對值，見表3。

表3 天麻樣品中各成分質量分數相對值結果Tab 3 Relative value of the mass of each component in the gastrodia sample

2.7 指紋圖譜的比較

2.7.1 化學成分種類和數目比較 通過指紋圖譜比較，天麻飲片、標準湯劑、配方顆粒的共有峰稍有差異，但基本保持穩定，這可能與提取過程中化學成分間的絡合、氧化、分解、成鹽等反應有關[15]。

2.7.2 指紋圖譜相關性比較 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”對天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒色譜圖分析。以S1 為參照圖譜（采用中位數法、時間寬度為0.2 min），進行多點校正和峰匹配，評價樣品相似度。結果與飲片（0.935）相比，標準湯劑（0.972）的相似度較高，配方顆粒（A 廠：0.879、B 廠：0.866、C 廠：0.854、D 廠：0.863）相似度稍低。說明與配方顆粒相比，標準湯劑更具有優勢；配方顆粒中各廠家存在較小差異，這可能與各廠家的制備工藝有關[16]，提示了統一制備工藝、加強質量管理的重要性。

2.7.3 共有峰總峰面積比較 以天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒共有的特征峰（11 個，峰1，峰3 ～峰7，峰9 ～峰13）為研究對象，計算天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒共有峰總峰面積的均值。以12 批飲片共有峰總峰面積的均值為基準1，計算標準湯劑及配方顆粒的相對值[6]。結果天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒共有峰總峰面積的相對值為飲片（1.00）、標準湯劑（0.91）、配方顆粒（A 廠：0.62、B 廠：0.47、C 廠：0.52、D 廠：0.65）。

2.7.4 已知化學成分含量比較 由表3可知，以12 批飲片中各成分質量分數的均值為基準1，計算天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒的相對值，結果與飲片相比標準湯劑中各成分質量分數相對值除巴利森苷A（0.654）有所降低外，其余5 種成分基本保持一致；配方顆粒中各成分質量分數相對值均有不同程度的降低，其中天麻素降低不明顯（0.896），巴利森苷A 降低最為突出（0.204），6 種成分相對值順序為天麻素＞巴利森苷C ＞對羥基苯甲醇＞巴利森苷E ＞巴利森苷B ＞巴利森苷A。采用GraphPad Prism8.0.2（263）軟件將表3數據生成含量測定結果熱圖，顏色越深表明相對值越大；反之顏色越淺相對值越?。ㄒ妶D3）。

圖3 天麻樣品含量測定相對值結果熱圖Fig 3 Heat map of relative value of content in gastrodia sample

2.7.5 天麻樣品聚類分析 將天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒供試品共有特征峰（11 個）峰面積數據及6 種指標成分含量測定的數據進行z-score標準化處理后，采用SPSS 20.0 軟件分別對樣品進行聚類分析。結果共有峰峰面積及指標成分含量測定的聚類結果一致，即在歐氏平方距離為10時，可將樣品分為兩類，其中CFG1 ～CFG12聚合為一類，其余樣品為一類。采用SIMCA 14.1 軟件對樣品聚類分析和OPLS-DA 分析，以特征值＞1 為提取標準，共有峰峰面積數據組共得到4 個成分，累積方差貢獻率94.6%，指標成分含量數據組共得到3 個成分，累積方差貢獻率93.2%，均能概括色譜圖絕大部分信息。結果，PCA 和OPLS-DA 均將樣品分為兩類，CFG1 ～CFG12 聚合為一類，其余樣品為一類，與聚類分析結果一致，見圖4。

圖4 天麻樣品聚類分析結果Fig 4 Cluster analysis of common peak area of gastrodia

根據上述結果，可知以飲片為基準，標準湯劑相比配方顆粒的優勢明顯；不同廠家的天麻配方顆粒間質量基本保持穩定[16]，這可能與配方顆粒的制備工藝等差異有關，提示了統一配方顆粒制備工藝的重要性和建立配方顆粒全面質量控制體系迫切性[6]。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本試驗考察了不同色譜柱（Phenomenex、Agilengt、YMC），不同流動相[（乙腈-（0.1%磷酸-水）、乙腈-（0.05%磷酸-水），不同流速（1、0.8 mL·min-1）]，不同柱溫（30、35 ℃），不同檢測波長（220、270 nm）等對色譜圖的影響，最終確定本研究的色譜方法。

3.2 指紋圖譜比較的分析

本研究采用指紋圖譜法比較了天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒間的差異，發現三者相似度均大于0.854，說明雖然受制備工藝差異影響，但是生藥來源是基本相同的，所以相似度較高[6，17]。共有峰數由飲片的13 個，標準湯劑的12 個到配方顆粒的12 個，說明三者在化學成分種類上基本一致，通過共有峰總峰面積的比較，發現與飲片相比標準湯劑及配方顆粒均有不同程度的降低，天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒的相對值為飲片（1.00）、標準湯劑（0.91）、配方顆粒（A 廠：0.62、B 廠：0.47、C 廠：0.52、D 廠：0.65），說明標準湯劑與飲片相比基本保持一致，而配方顆粒中各成分的含量相對于飲片均有不同程度降低，提示了配方顆粒標示量與實際量存在誤差，在臨床應用中應進行修正。

3.3 指標成分選定及比較分析

天麻中化學成分復雜，以往天麻僅用天麻素與對羥基苯甲醇為評價指標，不能全面評價天麻的產品質量，本文增加了巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 4 個成分，以上均是天麻重要的活性成分，具有抗驚厥、鎮痛、鎮靜、祛風通絡等多種藥理作用[2-4，18-19]，故本文選擇上述6 種成分為指標成分研究天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒的相關性和差異。

本研究通過對比天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒中6 種成分的含量測定結果，發現與飲片相比標準湯劑中各成分質量分數除巴利森苷A 降低外，其余5 種成分基本保持一致；配方顆粒中各成分質量分數均有不同程度的降低，其中天麻素降低不明顯，巴利森苷A 降低最為突出。說明與飲片及標準湯劑相比配方顆粒中各化學成分含量有不同程度的降低，提示配方顆粒建立全面質量控制標準的重要性。

3.4 小結

綜上分析，天麻飲片、標準湯劑及配方顆?；瘜W成分種類基本保持一致，但各成分質量分數存在一定差異，其中配方顆粒中含量降低較為突出，反映了配方顆粒應加強質量控制、調整臨床使用當量，以促進天麻配方顆粒的臨床合理應用。本研究采用指紋圖譜和化學模式識別方法，從定性和定量兩個方面，對比天麻飲片、標準湯劑及配方顆粒的相關性與差異，課題組今后將從臨床療效和譜效關系繼續深入研究，以期為天麻的臨床應用提供參考。