復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊含量測定標準提升研究

漆欣筑，祝 晶，何劼毅，黃翰林

(貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004)

0 引言

復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊為鹽酸二甲雙胍與格列吡嗪的復方制劑，臨床上用于改善II型糖尿病患者的血糖控制[1-4]。目前，復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊在國內尚屬獨家品種，現行的標準為《國家藥品標準》化學藥品地方標準上升國家標準第七冊，檢驗項目較為簡單，其中含量測定部分為紫外分光光度法測定鹽酸二甲雙胍的含量[5]，該方法靈敏度低、專屬性較差，易導致測量結果不準確[6]，且原標準中未對格列吡嗪的含量進行控制。

為了更好地控制藥品質量，定量測定2個有效成分的準確含量，本研究擬對原標準中的含量測定部分進行提升，將鹽酸二甲雙胍的含量測定方法由UV法修訂為高效液相色譜(HPLC)法，并增加了格列吡嗪的HPLC含量測定法，提升后的含量測定方法專屬性強、準確度高，對提高產品的質量可控性有較好的幫助[7～9]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀(島津20A、Thermo Ultimate3000、Agilent1260)，電子天平(METTLER TOLEDO XS205、METTLER TOLEDO AE240S)，C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，SHISEDO、Agilent、Thermo)。

1.2 藥品與試劑

復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊(廠家送檢)，鹽酸二甲雙胍原料藥、格列吡嗪原料藥、肉桂提取物、淀粉(以上原料及原料藥由廠家提供)，格列吡嗪對照品(來源：中檢院，批號：100281-201203)，庚烷磺酸鈉，磷酸二氫鈉，甲醇，純化水(實驗室自制)。

2 實驗部分

2.1 色譜條件與系統適應性試驗

鹽酸二甲雙胍含量測定色譜條件：色譜柱采用C18柱；以庚烷磺酸鈉與磷酸二氫鈉的混合溶液(取庚烷磺酸鈉1 g，加0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液1 000 mL使溶解)-甲醇(80∶20，V∶V)為流動相；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長為233 nm。理論板數按鹽酸二甲雙胍計算不低于3 000，鹽酸二甲雙胍與相鄰色譜峰的分離度應符合要求。

格列吡嗪含量測定色譜條件：色譜柱采用C18柱；以庚烷磺酸鈉與磷酸二氫鈉的混合溶液(取庚烷磺酸鈉1 g，加0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液1 000 mL使溶解)-甲醇(45∶55，V∶V)為流動相；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長為225 nm。理論板數按格列吡嗪計算不低于3 000，格列吡嗪與相鄰色譜峰的分離度應符合要求。

2.2 測定方法

鹽酸二甲雙胍含量測定方法：取裝量差異項下的內容物，混合均勻，精密稱取適量(約相當于鹽酸二甲雙胍125 mg)，置100 mL量瓶中，加水適量振搖使鹽酸二甲雙胍溶解，稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取鹽酸二甲雙胍對照品，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 mL中約含25 μg的溶液，同法測定，按外標法以峰面積計算，即得。

格列吡嗪含量測定方法：取裝量差異項下的內容物，混合均勻，精密稱取適量(約相當于格列吡嗪2.5 mg)，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL，振搖使格列吡嗪溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取格列吡嗪對照品約12.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇30 mL，振搖使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5.0 mL置50 mL量瓶中，用60%甲醇溶液稀釋至刻度，作為對照品溶液，同法測定。

3 鹽酸二甲雙胍含量測定方法學驗證

3.1 專屬性試驗

溶液配制：精密稱取鹽酸二甲雙胍原料藥125 mg、格列吡嗪原料藥2.5 mg、肉桂提取物150 mg、淀粉約70 mg，分別置100 mL量瓶中，加水適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0 mL置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得鹽酸二甲雙胍溶液、格列吡嗪溶液、肉桂提取物溶液及淀粉溶液。

鹽酸二甲雙胍陰性溶液：精密稱取格列吡嗪原料藥2.5 mg，置100 mL量瓶中，加水適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0 mL置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

混合溶液：精密稱取鹽酸二甲雙胍原料藥125 mg、格列吡嗪原料藥2.5 mg、肉桂提取物150 mg、淀粉約70 mg，置100 mL量瓶中，加水適量，振搖使溶解，并加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0 mL置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

分別精密量取上述溶液和配制用水各20 μL，照鹽酸二甲雙胍含量測定方法進樣。試驗結果表明，鹽酸二甲雙胍陰性溶液色譜圖中未見鹽酸二甲雙胍色譜峰，色譜圖顯示其他各組分及配置用水均不會對鹽酸二甲雙胍的含量測定產生干擾，混合溶液中鹽酸二甲雙胍色譜峰與鹽酸二甲雙胍原料藥色譜峰保留時間一致，分離度符合要求。該方法專屬性好，能有效分離待測組分與其他組分，如圖1所示。

圖1 混合對照品溶液(A)；不含鹽酸二甲雙胍陰性對照溶液(B)Fig.1 Mixture reference (A); Non metformin hydrochloride negative sample (B)

3.2 線性考察

儲備液制備：精密稱取鹽酸二甲雙胍對照品25.0 mg，置100 mL量瓶中，加水振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

80%、90%、100%、110%、120%線性溶液：分別精密量取線性貯備液8.0 mL、9.0 mL、10.0 mL、11.0 mL、12.0 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

根據含量測定方法取上述5種不同濃度的線性溶液各20 μL進樣。試驗結果表明，鹽酸二甲雙胍在20.07～30.11 μg/mL范圍內呈良好的線性關系(圖2)。

圖2 鹽酸二甲雙胍線性結果Fig.2 The standard curve line of metformin hydrochloride

3.3 精密度考察

照含量測定方法，精密量取專屬性試驗中混合溶液20 μL進樣，重復進樣6次，記錄色譜圖，考察儀器精密度，以峰面積計算精密度，RSD為0.12%。

取鹽酸二甲雙胍格列吡嗪膠囊20粒，取混合均勻的內容物，平行處理6份樣品，照含量測定方法進樣，記錄色譜圖，考察方法精密度，以峰面積計算精密度，RSD為0.05%。試驗表明，儀器精密度與方法精密度均良好。

3.4 穩定性考察

取樣品1粒，照含量測定方法中供試品溶液配制方法處理，作為供試品溶液，放置在室溫條件下，經0 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h分別精密量取供試品溶液20 μL進樣，記錄色譜圖，以峰面積計算穩定性，RSD為0.61%，試驗結果表明：供試品溶液在8 h內穩定性良好。

3.5 回收率考察

精密稱取鹽酸二甲雙胍對照品1.25 g，置200 mL量瓶中，加水適量，振搖使溶解并稀釋至刻度，作為回收率貯備液。精密稱取樣品適量，加回收率貯備液后制成高濃度樣品溶液(120%)、中濃度樣品溶液(100%)、低濃度樣品溶液(80%)3份，照含量測定方法進樣，記錄色譜圖，計算回收率分別為99.09%、100.00%、99.73%、99.34%、99.11%、100.62%、101.19%、101.03%、101.03%，平均回收率為99.8%，RSD為0.95%，試驗結果表明，該方法回收率良好。

3.6 耐用性考察

分別使用正常色譜條件，不同柱溫(30±5)℃、不同流速(1.0±0.1)mL/min、不同流動相比例、不同色譜柱(Thermo C18、Agilent C18、SHESEIDO C18)以及不同的液相色譜儀(島津、Agilent、Thermo)進行測試，分別計算，對鹽酸二甲雙胍含量進行考察。結果顯示鹽酸二甲雙胍含量的RSD為0.45%，含量耐用性較好。

4 格列吡嗪含量測定方法學驗證

4.1 專屬性試驗

溶液配制：精密稱取鹽酸二甲雙胍原料藥125 mg、格列吡嗪原料藥2.5 mg、肉桂提取物150 mg、淀粉約70 mg，分別置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL振搖使溶解，并加水稀釋至刻度，搖勻，即得鹽酸二甲雙胍溶液、格列吡嗪溶液、肉桂提取物溶液及淀粉溶液。

格列吡嗪陰性溶液：精密稱取鹽酸二甲雙胍原料藥125 mg、肉桂提取物150 mg、淀粉約70 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL振搖使溶解，并加水稀釋至刻度，搖勻，濾過即得。

混合溶液：精密稱取鹽酸二甲雙胍原料藥125 mg、格列吡嗪原料藥2.5 mg、肉桂提取物150 mg、淀粉約70 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL振搖使溶解，并加水稀釋至刻度，搖勻，濾過即得。

分別精密量取上述溶液和60%甲醇溶液各20 μL進樣，記錄色譜圖。試驗結果表明，格列吡嗪陰性溶液色譜圖中未見格列吡嗪色譜峰，其他各組分及溶劑色譜圖顯示均不會對格列吡嗪的含量測定產生干擾，混合溶液中格列吡嗪色譜峰與格列吡嗪原料藥色譜峰保留時間一致，分離度符合要求。該方法專屬性好，能有效分離待測組分與其他組分(圖3)。

圖3 混合對照品溶液(A)；不含格列吡嗪陰性對照溶液(B)Fig.3 Mixture reference (A);Non glipizide negative sample (B)

4.2 線性考察

線性貯備液制備：精密稱取格列吡嗪對照品25.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇60 mL振搖使溶解，并加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%線性溶液：分別精密量取線性貯備液7.0 mL、8.0 mL、9.0 mL、10.0 mL、11.0 mL、12.0 mL、13.0 mL，置100 mL量瓶中，加60%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。根據含量測定方法取上述7種不同濃度的線性溶液各20 μL進樣。

試驗結果表明，格列吡嗪在17.48～32.45 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，結果見圖4。

圖4 格列吡嗪線性關系考察結果Fig.4 The standard curve line of glipizide

4.3 精密度考察

參照格列吡嗪含量測定方法及3.3試驗方法對儀器精密度及方法精密度進行考察，以峰面積計算精密度，儀器精密度RSD為0.45%，方法精密度RSD為0.43%，試驗表明，儀器精密度與方法精密度均良好。

4.4 穩定性考察

精密稱取樣品1粒，照含量測定方法中供試品溶液配制方法處理，作為供試品溶液，放置在室溫條件下，經0 h、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h分別精密量取供試品溶液20 μL進樣，記錄色譜圖，以峰面積計算穩定性，RSD為0.3%，試驗結果表明：供試品溶液在8 h內穩定性良好。

4.5 回收率考察

精密稱取格列吡嗪對照品25 mg，置200 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為回收率貯備液。精密稱取樣品適量，以60%甲醇作為溶劑，加回收率儲備液后制成高濃度樣品溶液(120%)、中濃度樣品溶液(100%)、低濃度樣品溶液(80%)3份，照含量測定方法進樣，記錄色譜圖，計算回收率分別為100.20%、100.10%、99.10%、99.46%、100.80%、99.25%、99.48%、98.82%、100.10%，平均回收率為99.7%，RSD為0.64%，試驗結果表明，該方法回收率良好。

4.6 耐用性考察

分別使用正常色譜條件，不同柱溫(30±5)℃、不同流速(1.0±0.1)mL/min 、不同流動相比例、不同色譜柱(Thermo C18、Agilent C18、SHESEIDO C18)以及不同的液相色譜儀(島津、Agilent、Thermo)進行測試，分別計算，對鹽酸二甲雙胍含量進行考察。結果所有格列吡嗪含量的RSD為0.65%，含量測定方法耐用性較好。

5 樣品含量測定

通過已建立的方法對3批樣品的鹽酸二甲雙胍及格列吡嗪含量進行測定，結果顯示：鹽酸二甲雙胍含量在97.53%～100.26%之間、格列吡嗪的含量在99.83%～101.71%之間。說明該方法可以測定鹽酸二甲雙胍格列吡嗪中鹽酸二甲雙胍和格列吡嗪的含量，結果見表1和表2。

表1 3批樣品鹽酸二甲雙胍含量測定結果Tab.1 Determination results of metformin hydrochloride in 3 batches of samples

表2 3批樣品格列吡嗪含量測定結果Tab.2 Determination results of glipizide in 3 batches of samples

6 討論

復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊遼寧修和藥業有限公司的獨家品種，有臨床試驗數據顯示，使用該復方制劑比單獨使用二甲雙胍或格列吡嗪更顯著的降低II型糖尿病患者的糖化血紅蛋白水平，同時患者的依從性、耐受性好，因此該制劑在臨床上使用較為廣泛[9-10]。按照本文建立的含量測定方法對鹽酸二甲雙胍格列吡嗪膠囊進行含量測定，在測定條件下其他物質對于鹽酸二甲雙胍及格列吡嗪的測定均無干擾，測定結果可信，耐用性好，表明建立的方法具有廣泛的適用性，可以準確測定復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊中鹽酸二甲雙胍、格列吡嗪的含量，能有效控制復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊的質量，對復方二甲雙胍格列吡嗪膠囊質量標準的制定有一定的提升作用。