miR-145-5p通過TCTP調節膠質瘤細胞對DMC-BH的耐藥性

程超, 孫關, 石磊

膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤[1]。GBM的特點是增殖快、侵襲性強、血管生成豐富、對放化療均不敏感等。加上腫瘤的境界不清，往往無法做到全切[2-3]。替莫唑胺(TMZ)是目前抗膠質瘤的一線化療藥物，但它同樣面臨的一個問題是耐藥，而耐藥性是影響化療療效的主要因素[4]。先前的研究表明，耐藥性是一個復雜的過程，涉及許多基因，包括微 RNA (microRNA, miRNA)[5]。

DMC-BH是雙脫甲氧基姜黃素的衍生物，為本實驗室開發的一個專利化合物，已證明其可有效地通過血腦屏障，對膠質母細胞瘤及其干細胞均有明顯的抑制作用，并優于TMZ[6-7]。但DMC-BH同樣存在耐藥問題。研究報道miR-145在許多惡性腫瘤中高表達[8]。但與正常腦組織相比，miR-145 在神經膠質瘤細胞中呈低表達，并負向調節腫瘤發生；過表達 miR-145可顯著降低膠質瘤體外增殖、遷移和侵襲[9]。近年來miR-145已越來越多地被確定為致癌作用和治療耐藥性的關鍵抑制因子[8]。Hua等[10]發現miR-145-5p 在神經膠質瘤細胞以及對替莫唑胺耐藥的神經膠質瘤細胞中表達過低,過表達miR-145-5p 可抑制耐藥的U251/TMZ細胞增殖。

在本實驗中，我們分析了miR-145-5p在 U87/DMC-BH和U251/DMC-BH耐藥細胞中的表達，觀察其對 DMC-BH耐藥細胞的細胞活性和耐藥相關基因表達的影響，探討miR-145-5p調節DMC-BH耐藥的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

U87和U251細胞系購自中科院上海細胞庫。 RIPA裂解液(KGP702)購自南京凱基生物科技有限公司。超敏ECL發光液(P0018AM)購自上海碧云天生物技術有限公司。TRIZOL購自美國Sigma-Aldrich公司。agomiR-145-5p (cat.miR40000437-4-5), agomir NC (cat.miR4N0000001-4-5), TCTP siRNA (siB11525134333-1-5) 和陰性對照(siRNAnc)購自廣州市銳博生物科技有限公司。miDETECT A TrackTMmiRNAqPCR Kit(cat.C10711)、miDETECT A TrackTMUni-Reverse Primer、miDETECT A Track hsa-miR-145-5p Forward Primer(cat.miRA0000437-1-100)和miDETECT A TrackTMU6 Forward Primer(cat.miRAN0002)均購自廣州市銳博生物科技有限公司。將翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)的DNA編碼序列擴增并亞克隆在pCDNA3.1(+)載體(Invitrogen, Carlsbad, CA)的BamHI和EcoRI位點之間，構建TCTP過表達載體(pcDNA3.1-TCTP)。TCTP、GAPDH抗體購自蘇州錦博生物科技有限公司。MRP1、MDR1購自美國Abcam公司。高糖DMEM培養基購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 DMC-BH耐藥細胞株構建 U87和U251細胞用含10% 胎牛血清(FBS )、100 U/ml 青霉素 G 和100 mg/ml 鏈霉素(Sigma-Aldrich，美國)的 DMEM 培養基中培養,置于 37 ℃ 、5%CO2孵箱。采用逐步增加DMC-BH濃度的方法誘導耐藥細胞株。取對數生長的1×105/ml細胞懸液，加入起始濃度1 μmol/L DMC-BH培養24 h后，更換新鮮培養基繼續培養15 d。消化傳代后，再加入1倍濃度的 DMC-BH繼續培養，直至DMC-BH濃度達到終濃度20 μmol/L。經過6個月左右時間建成DMC-BH耐藥細胞株命名為U87/DMC-BH和U251/DMC-BH。

1.2.2 miR-145-5p細胞轉染 將8×103個 U87或U251細胞種植于96孔板中，加入1 μl 20 μmol/L agomir，使局部濃度達到400 nmol/L，轉染24～72 h后，熒光定量PCR檢測miRNA的表達水平變化。TCTP siRNA和pcDNA3.1-TCTP轉染：2×105個 U87或U251細胞種植于12孔板中，置于 37 ℃ 、5%CO2孵箱培養24 h后，利用Lipofectamine 3000按照1.5 μl∶1 μg DNA(v∶w)轉染細胞。轉染24～72 h后，Western blot 檢測TCTP 蛋白表達。

1.2.3 熒光定量PCR檢測 各組經處理的細胞利用TRIzol提取總 RNA。采用miDETECT A TrackTMmiRNAqPCR Kit分析miR-145-5p表達水平。1 μg總 RNA與miDETECT A TrackTMUni-RT Primer混合后，42 ℃反應1 h得到總cDNA，-20 ℃保存。將 2 μlcDNA與miDETECT A TrackTMUni-Reverse Primer和miDETECT A Track hsa-miR-145-5p Forward Primer混合。U6 Primer作為內參引物。擴增條件如下：95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40個循環。使用 2-ΔΔCt方法計算比較閾值循環 (Ct) 值。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖 將3×103細胞/孔接種在 96 孔板中，并在 37 ℃、5%CO2的孵箱中培養24 h。然后轉染miR-145-5p agomir、TCTP siRNA(si-TCTP)或pcDNA3.1-TCTP (p-TCTP)干預細胞指定時間后，每孔加入 10 μl CCK-8溶液，繼續孵育4 h。隨后，使用酶標儀(Sunrise，Tecan，澳大利亞)在 450 nm 處測量吸光度。

1.2.5 流式細胞檢測細胞凋亡 各組經處理的細胞經不含EDTA的0.25%胰酶消化后，1 000 g 離心5 min。棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞。然后，先后加入5 μl Annexin V-FITC，10 μl PI染色液，輕輕混勻，室溫20～25 ℃避光孵育10～20 min后，流式細胞儀檢測。

1.2.6 Western blot檢測 各組經處理的細胞利用RIPA裂解液提取總蛋白?？偟鞍装凑?0 μg/泳道加入10%SDS-PAGE分離膠中在140 V恒壓下電泳 50 min。之后，在300 mA 恒流下轉膜60 min，將蛋白轉移到 PVDF 膜上。在5%脫脂牛奶中封閉1 h后，將膜與以下一抗MRP1(1∶1 000)和MDR1(1∶1 000)孵育4 ℃過夜。TBST洗滌3次，每次5 min。之后，加入二抗(1∶2 000)繼續孵育2 h。TBST洗滌3次，每次5 min。加入超敏ECL發光液顯影。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 miR-145-5p對DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株增殖和凋亡的影響

熒光定量PCR分析miR-145-5p在DMC-BH耐藥的膠質瘤細胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH和非耐藥細胞株U87和U251之間的表達水平，見圖1A。miR-145-5p在U87/DMC-BH中的表達水平是在U87中的32.3%，在U251/DMC-BH中的表達水平是在U251中的22.1%，miR-145-5p在U87/DMC-BH的表達水平低于U87，在U251/DMC-BH中表達水平低于在U251，差異均有統計學意義(P<0.05)。轉染agomiR-145-5p后，熒光定量PCR檢測示miR-145-5p在轉染組細胞中的表達高于U87/DMC-BH和U251/DMC-BH組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1B。CCK-8提示U87/DMC-BH和U251/DMC-BH轉染agomiR-145-5p后，24 h、48 h、72 h細胞的增殖活性下降，各時間點差異有統計學意義(P<0.05)。72 h時間點細胞存活率分別為agomir NC組的46.5%和38.4%，見圖1C。流式細胞儀分析顯示，agomiR-145-5p轉染48 h后U87/DMC-BH和U251/DMC-BH細胞凋亡增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1D。Western blot檢測提示，轉染agomiR-145-5p后U87/DMC-BH和U251/DMC-BH細胞耐藥相關蛋白MRP1和MDR1表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1E、1F。

1A：熒光定量PCR分析miR-145-5p在DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH中的表達低于非耐藥細胞株U87和U251(**P<0.05)；1B：熒光定量PCR檢測細胞轉染agomiR-145-5p后，miR-145-5p表達水平上升(**P<0.05)；1C：CCK-8檢測示U87/DMC-BH和U251/DMC-BH轉染agomiR-145-5p后，24 h、48 h、72 h細胞的增殖活性下降(**P<0.05)；1D：流式細胞儀檢測，agomiR-145-5p轉染后U87/DMC-BH和U251/DMC-BH細胞凋亡增加(**P<0.05)；1E：Western blot檢測，轉染agomiR-145-5p后U87/DMC-BH和U251/DMC-BH細胞耐藥相關蛋白MRP1表達下降(**P<0.05)；1F：Western blot檢測染agomiR-145-5p后U87/DMC-BH和U251/DMC-BH細胞耐藥相關蛋白MDR1蛋白表達下降(**P<0.05)圖1 miR-145-5p過表達對DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株增殖和凋亡的作用

2.2 miR-145-5p調節DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株中TCTP表達

Western blot檢測耐藥膠質瘤細胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH中TCTP蛋白的表達水平高于非耐藥細胞株U87和U251，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2A。而利用agomiR-145-5p轉染增加miR-145-5p表達后，耐藥細胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH中的TCTP蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2B。

2A：Western blot檢測TCTP蛋白在U87、U87/DMC-BH、U251和U251/DMC-BH中的表達水平，耐藥膠質瘤細胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH中TCTP蛋白的表達水平高于非耐藥細胞株U87和U251(**P<0.05)；2B：Western blot檢測上調miR-145-5p后，耐藥細胞株U87/DMC-BH和U251/DMC-BH中的TCTP蛋白表達下降(**P<0.05)圖2 miR-145-5p調節DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株中TCTP表達

2.3 下調TCTP對DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株增殖和凋亡的影響

Western blot驗證，U87/DMC-BH和U251/DMC-BH轉染TCTP siRNA后，耐藥細胞株中的TCTP蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3A。進一步增殖實驗分析轉染72 h后，CCK-8提示TCTP siRNA組細胞的增殖活性較對照組(siRNAnc)下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3B。流式細胞儀分析，TCTP siRNA轉染后，U87/DMC-BH和U251/DMC-BH細胞凋亡增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3C。

3A：U87/DMC-BH和U251/DMC-BH轉染TCTP siRNA后，耐藥細胞株中的TCTP蛋白表達下降(**P<0.05)；3B：CCK-8提示，TCTP siRNA轉染后，U87/DMC-BH和U251/DMC-BH細胞的增殖活性下降(**P<0.05)；3C：流式細胞儀分析，TCTP siRNA轉染后，U87/DMC-BH和U251/DMC-BH細胞凋亡增加(**P<0.05)圖3 TCTP siRNA對DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株活性的影響

2.4 共轉染TCTP過表達載體(pcDNA3.1-TCTP)和agomiR-145-5p對DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株增殖和凋亡的影響

共轉染TCTP過表達載體(pcDNA3.1-TCTP)和agomiR-145-5p后，耐藥細胞株中TCTP的表達較單獨轉染agomiR-145-5p增高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4A；agomiR-145-5p轉染造成的細胞增殖抑制和凋亡增加也得到了恢復，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4B、4C；耐藥基因MRP1和MDR1的相應蛋白表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4D、4E。

4A：共轉染pcDNA3.1-TCTP和agomiR-145-5p后，耐藥細胞株中TCTP的表達較單獨轉染agomiR-145-5p增高(**P<0.05)；4B：共轉染pcDNA3.1-TCTP和agomiR-145-5p后， U87/DMC-BH和U251/DMC-BH細胞增殖較單獨轉染agomiR-145-5p細胞增加(**P<0.05)；4C：共轉染pcDNA3.1-TCTP和agomiR-145-5p后， U87/DMC-BH和U251/DMC-BH細胞凋亡較單獨轉染agomiR-145-5p減少(**P<0.05)；4D：共轉染pcDNA3.1-TCTP和agomiR-145-5p后，MRP1蛋白表達較單獨轉染agomiR-145-5p增加(**P<0.05)；4E：共轉染pcDNA3.1-TCTP和agomiR-145-5p后，MDR1蛋白表達較單獨轉染agomiR-145-5p增加(**P<0.05)圖4 共轉染TCTP過表達載體(pcDNA3.1-TCTP)和agomiR-145-5p對DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株增殖和凋亡的影響

3 討論

膠質母細胞瘤對放化療均不敏感，耐藥是膠質瘤母細胞化療失敗的最主要因素。目前認為化療藥物耐藥性的機制主要包括藥物失活、腫瘤細胞藥物外排、損傷修復、激活促生存信號通路和抑制細胞死亡通路等。但具體到每一種藥物及每種腫瘤細胞其機制并不一致。

DMC-BH是通過對天然化合物DMC結構改良得到的一種化合物，表現出與臨床一線藥物TMZ相似的體內抗膠質瘤效應[6-7]。但長期長時間使用 DMC-BH仍然會導致耐藥性的產生，并不能使原位移植瘤消失[7]。因此，理解膠質瘤細胞對DMC-BH耐藥的產生機制有助于進一步破解其耐藥性，提高 DMC-BH抗膠質瘤療效，進一步有助于發現克服耐藥的一些新的分子靶向治療手段。

miR-145-5p首次在纖維肌痛患者中被報道，與健康對照組相比，miR-145-5p在纖維肌痛患者中的表達水平顯著降低，并與纖維肌痛患者疼痛和疲勞有關[11]。近年來研究報道 miR-145-5p在結腸癌、肝癌、乳腺癌等包括膠質瘤在內的多種腫瘤組織中表達異常[12-15]。Zhang等[16]研究發現與Ⅰ/Ⅱ級膠質瘤患者和健康對照組相比，GBM患者的血清miR-145-5p水平顯著降低；而血清miR-145-5p降低是GBM一個有效的診斷和預后生物標志物。同樣，與對照組相比，miR-145-5p在膠質瘤組織和細胞中也顯著下調[17]，而抑制miR-145-5p可促進膠質瘤細胞惡性進程[18]，但miR-145-5p在調節膠質瘤化療耐藥性方面研究仍然知之甚少。

在本研究中，我們發現miR-145-5p在增強膠質瘤細胞對DMC-BH的敏感性方面起著重要作用。miR-145-5p參與調節DMC-BH的化療耐藥性。miR-145-5p在DMC-BH耐藥的膠質瘤細胞株中表達較非耐藥株更低。而通過外源性轉染上調miR-145-5p表達后，耐藥的膠質瘤細胞株出現增殖活性下降，細胞凋亡增加。先前研究者發現miR-145調控膠質瘤干細胞遷移和侵襲的功能是通過其靶向ABCG2 mRNA介導的[19]。ABCG2是一種ATP結合盒轉運蛋白，在GSC和更高級別的膠質瘤組織中過度表達。ABCG2的過度表達被認為是限制各種化合物在細胞內積累的重要機制之一。ABCG2具有廣泛的底物譜，包括各種抗癌藥物和環境致癌物，其功能與多藥耐藥(MDR)和腫瘤發展有關。在本研究中我們發現miR-145-5p可能是通過調節TCTP蛋白表達實現的。TCTP蛋白在耐藥細胞株中呈高表達。而過表達miR-145-5p表達后耐藥細胞株中的TCTP蛋白表達出現下降。利用小干涉RNA沉默TCTP后，耐藥細胞株細胞也出現明顯的增殖活性下降和凋亡增加。過表達TCTP表達后，miR-145-5p對DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株增殖和凋亡的作用出現了逆轉。這些證據表達miR-145-5p通過調節TCTP表達實現了對DMC-BH耐藥膠質瘤細胞株耐藥性調節。

綜上所述， miR-145-5p可增強膠質瘤細胞株對DMC-BH耐藥的敏感性，而這種作用是通過靶向調節TCTP實現的。