MEBO 聯合微粒皮種植對糖尿病足創面組織中VEGF、 EGF 表達水平的影響

戚世玲 劉 清 何仁亮 朱定衡 馮 雷 謝志敏 方培炫 朱 璐

糖尿病足是糖尿病患者常見且嚴重的并發癥之一， 多由周圍神經病變、 外周血管病變和感染等多種因素相互作用所致， 且機體長期處于高糖環境引起的血管損傷、 組織細胞功能紊亂、 神經營養因子表達水平降低、 生長因子減少等還可導致創面遷延不愈， 治療難度較大， 給患者家庭和社會造成了巨大的經濟負擔［1］。 目前， 臨床治療糖尿病足的主要方法有藥物外用、 手術植皮、 富血小板血漿外敷、負壓封閉引流、 干細胞移植、 高壓氧療、 組織工程技術以及各種敷料外敷等， 其中干細胞移植、 負壓封閉引流以及銀離子凝膠等新型敷料的價格高昂［2－3］， 且部分治療方法治療周期較長、 換藥次數頻繁， 臨床難以推廣。 因此， 探尋安全有效且價格低廉的糖尿病足創面治療方法仍是臨床研究的重點。 近年來有研究證實， 濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment， MEBO） 聯合微粒皮種植治療糖尿病足創面的療效較好， 且價格相對低廉［4］。 基于此， 本研究筆者鑒于血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） 與表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF） 可間接反映創面的愈合情況［5］， 于本研究中觀察了MEBO 聯合微粒皮種植對糖尿病足創面組織中VEGF、 EGF 表達水平的影響， 以期為該療法的臨床應用提供理論依據。

1 臨床資料

1.1 一般資料

本組患者共38 例， 均為2018 年1 月至2020年12 月廣州醫科大學附屬第五醫院收治的Wagner 2 ～3 級糖尿病足患者， 其中男性21 例、 女性17例， 年齡（63.6 ±8.3） 歲， 糖尿病病程（9.3 ±2.2） 年， 糖尿病足病程（61.6 ±22.4） d， Wagner分級為2 級33 例、 3 級5 例， 糖化血紅蛋白（8.4 ±1.2）%。 本研究經廣州醫科大學附屬第五醫院醫學倫理委員會批準， 且所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準： 符合2 型糖尿病及糖尿病足的診斷標準； Wagner 分級為2 ～3 級； 經常規治療無明顯好轉或持續惡化， 且經綜合治療后能承受微粒皮種植治療； 對本研究知情同意。 排除標準： 合并有嚴重心、 腦、 肺、 肝、 腎等重要器官功能障礙； 合并有惡性腫瘤； 合并有認知功能障礙或精神類疾病，依從性較差； 入選前長期接受糖皮質激素、 免疫抑制劑及化療藥物治療； 對本研究所用藥物成分過敏或為過敏體質； 妊娠期及哺乳期女性。

1.3 主要試劑與儀器

鼠抗人VEGF 及EGF 酶聯免疫吸附測定試劑盒： 美國Cell Signaling Technology 生產； 全波長酶標儀： 德國Thermo Fisher Scientific 生產； 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA） 蛋白定量試劑盒：北京雷根生物技術有限公司生產； 超聲勻漿器： 美國Biospec 生產； 低溫離心機： 美國Beckman Coulter生產。

2 方法

2.1 基礎治療

所有患者入院后均積極予以調控血糖、 血壓、血脂， 抗感染， 改善微循環， 營養神經， 調控飲食等對癥支持治療。

2.2 創面治療

局部創面于生理鹽水沖洗、 壞死組織清除后，均勻涂抹MEBO， 并依次覆蓋MEBO 藥紗及無菌敷料包扎， 每天換藥1 ～2 次； 待新生肉芽組織覆蓋創面后行微粒皮種植， 用眼科無齒鑷將微粒皮以間隔0.3 ～0.5 cm， 深0.2 ～0.3 cm 為準種植于創面中； 繼而依次覆蓋MEBO 藥紗及無菌敷料加壓包扎， 每天換藥1 次（換藥時去除創面殘余藥膏、 液化物及壞死組織后再涂新藥）， 直至創面完全愈合。

微粒皮制作： 選擇自身大腿健康皮膚， 常規消毒麻醉后， 按供皮區面積與創面面積比例為1∶20 ～30切取刃厚皮片， 剪成0.1 ～0.2 cm 的矩形微粒置于無菌生理鹽水中備用［6］； 供皮區創面予以無菌紗布加壓包扎， 每天換藥1 次， 直至創面完全愈合。

2.3 標本采集

分別于治療前及治療第7、 14 天測量創面面積， 并剪取0.1 cm ×0.1 cm 創面邊緣肉芽組織置于－80 ℃冰箱中保存備用。

2.4 VEGF、 EGF 含量測定

嚴格按照試劑盒說明書采用BCA 法檢測創面組織中總蛋白含量、 采用酶聯免疫吸附法檢測VEGF 及EGF 水平， 并以VEGF、 EGF 水平與總蛋白含量的比值表示每毫克組織中VEGF、 EGF 的含量。

2.5 統計學處理

采用SPSS 22.0 統計軟件對所得數據進行統計學分析， 符合正態分布的計量資料以及非正態分布數據進行對數轉換后以均數± 標準差（±s）表示， 采用重復測量方差分析； 創面面積與VEGF、EGF 含量的相關性采用Pearson 相關性分析； 均以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 創面愈合情況

治療前， 38 例患者創面面積為 （11.78 ±3.04） cm2； 治療過程中， 所有患者創面均逐漸縮小， 其中治療第7 天創面面積為（9.64±2.73） cm2，治療第14 天創面面積為（7.32 ±2.06） cm2； 治療2 個月后， 33 例患者創面完全愈合、 5 例患者創面明顯縮小。 典型病例圖片見圖1－2。

圖1 微粒皮種植治療前糖尿病足創面情況； 圖2 微粒皮種植治療3 個月后創面愈合Fig.1 The diabetic foot wound before micro?skin grafting； Fig.2 The wound was healed 3 months after the micro?skin grafting

3.2 治療前后VEGF、 EGF 含量對比

治療過程中， 38 例患者創面組織中VEGF 及EGF 含量均呈逐漸升高趨勢， 其中各時間點創面組織中VEGF 含量對比，P均＜0.001， 差異具有統計學意義； EGF 含量除治療前與治療第7 天對比，差異無統計學意義（P＞0.05） 外， 其余各時間點對比，P均＜0.001， 差異具有統計學意義， 詳見表1。

表1 治療前后糖尿病足創面組織中VEGF、 EGF 含量對比（pg／mg， ±s）Table 1 Comparison of levels of VEGF and EGF in diabetic foot wounds before and after treatment （pg／mg， ±s）

表1 治療前后糖尿病足創面組織中VEGF、 EGF 含量對比（pg／mg， ±s）Table 1 Comparison of levels of VEGF and EGF in diabetic foot wounds before and after treatment （pg／mg， ±s）

注： VEGF 為血管內皮生長因子， EGF 為表皮生長因子。 與治療前對比， aP ＜0.05， 差異具有統計學意義； 與治療第7 天對比， bP ＜0.05， 差異具有統計學意義Note： VEGF－vascular endothelial growth factor， EGF－epidermal growth factor. The differences were statistically significant compared with that before treatment （aP ＜0.05） and on day 7 of treatment （bP ＜0.05）

指標Indicator例數Number of cases治療前Before treatment治療第7 天Day 7 of treatment治療第14 天Day 14 of treatment F 值F value P 值P value VEGF 38 79.38 ±9.48 99.65 ±12.39a 125.17 ±14.06ab 136.076 ＜0.001 EGF 38 7.91 ±2.03 9.11 ±3.52 15.95 ±5.86ab 42.172 ＜0.001

3.3 創面組織中VEGF、 EGF 含量與創面面積的相關性分析

Pearson 相關系數分析結果顯示， 創面組織中VEGF、 EGF 含量與創面面積無明顯相關性（r＝0.181、 0.205，P＝0.833、 0.094）。

4 討論

據統計， 我國現有糖尿病患者約1.3 億， 糖耐量受損者（糖尿病前期） 約3.5 億， 而糖尿病足作為糖尿病患者常見且嚴重的并發癥， 50 歲以上的發病率高達8.1%， 且極易因合并感染、 局部微循環障礙及神經損害而使創面遷延不愈［7］。 糖尿病足是糖尿病患者致殘、 致死的主要原因之一， 如何快速高效修復糖尿病足創面一直是醫學領域亟待解決的難題。

自體微粒皮種植是一種臨床常用的創面修復方法， 操作簡便， 對手術設備及鎮痛要求較低， 易于推廣， 尤其適用于不能接受大面積皮膚移植或皮瓣移植的患者［8］。 自體微粒皮含有表皮、 真皮和皮下組織等皮膚全層結構， 且皮粒微小， 能夠與邊緣新生組織快速融合， 迅速封閉創面， 可明顯降低并發癥發生率及病死率， 被廣泛應用于臨床［9］。 MEBO是由黃芩、 黃柏、 黃連、 地龍、 罌粟殼等中草藥提取物制成的軟膏制劑， 具有清熱解毒、 祛腐生肌、活血化瘀等功效。 現代醫學研究證實， MEBO 能夠為創面創造立體式生理性濕潤環境， 并在創面表層形成一層保護膜， 從而隔絕外界細菌對創面的侵襲； 黃芩甙、 小檗堿等成分能夠破壞細菌生存環境， 抑制細菌繁殖及毒性物質釋放， 有效控制創面感染； 可與創面壞死組織發生水解、 酶解、 酸敗、皂化、 酯化和脂化等一系列生物化學反應， 無損傷地液化排除壞死組織； 可激活創面組織中的潛能再生細胞， 并將其轉化為干細胞， 再在原位增殖、 分化為創面各層組織細胞， 再生修復創面［10］； 同時，其內含有的碳水化合物、 脂肪酸、 氨基酸、 維生素等多種營養成分可為創面的再生修復提供充足的營養［11］。 本研究結果顯示， MEBO 聯合微粒皮種植治療2 個月后， 33 例糖尿病足患者創面完全愈合，5 例患者創面明顯縮小， 明顯短于李健等［12］研究顯示的前列地爾靜脈注射聯合潰瘍局部前列地爾經皮超聲電導透入治療糖尿病足的創面愈合時間。 可見， MEBO 聯合微粒皮種植可促進糖尿病足創面的愈合。 考慮與自體微粒皮種植術前使用MEBO 能夠促進肉芽組織生長， 為微粒皮的種植提供基礎， 以及自體微粒皮種植術后使用MEBO 能夠為微粒皮成活、 擴張提供充足的營養有關。

創面愈合是一個復雜而有序的動態生物學過程， 包括凝血、 炎癥反應、 肉芽組織形成和組織重塑4 個階段， 其中肉芽組織形成對創面愈合至關重要， 而創面組織中相關生長因子及其受體相對或絕對缺乏是導致創面肉芽組織難以形成的關鍵因素［13］。 近年來部分研究證實， 細胞外基質可通過分泌VEGF、 EGF 等因子而調節成纖維細胞、 血管內皮細胞、 角質形成細胞的活化、 增殖， 從而促進創面肉芽組織形成， 加快創面愈合。 VEGF 是特異性促血管內皮細胞生長因子， 具有多種生物活性，可有效促進血管內皮細胞增殖、 遷移， 增加血管通透性， 從而誘導新生血管形成。 EGF 是人體分泌的一種重要細胞生長因子， 可啟動創面修復程序， 促進成纖維細胞增殖及上皮細胞生長， 增強表皮細胞活力， 加快創面再生修復［14］。 唐乾利等［15］的研究發現， MEBO 能夠通過提高大鼠創面組織中VEGF及EGF mRNA 的表達水平而促進創面愈合。 本研究結果顯示， MEBO 聯合微粒皮種植治療后糖尿病足創面組織中VEGF、 EGF 含量均呈明顯升高的趨勢， 創面面積均呈明顯縮小的趨勢， 與以往研究結果一致［16］。 但Pearson 相關系數分析結果顯示， 創面組織中VEGF、 EGF 含量與創面面積無明顯相關性， 與VEGF、 EGF 及創面面積的變化趨勢不一致， 分析其原因可能與VEGF、 EGF 等相關生長因子之間相互制約有關， 有待進一步深入研究探討。

綜上所述， MEBO 聯合微粒皮種植促進糖尿病足創面愈合的作用機制可能與VEGF、 EGF 表達水平的上調有關， 但外源性VEGF、 EGF 是否能促進新生血管生成、 肉芽組織生長而促進創面愈合， 且其長期安全性、 耐受性以及最佳用藥濃度、 用藥時間等問題仍有待進一步深入研究探討。 另外， 糖尿病足的發病機制及創面修復過程還與多條信號傳導通路、多種細胞因子的共同參與有關， 因此， MEBO聯合微粒皮種植治療糖尿病足的作用機制還需大樣本、多中心的前瞻性研究進一步驗證， 以期為創面的臨床治療提供確切的理論依據以及新的思路和策略。