混菌發酵、酒泥陳釀結合β-葡聚糖酶對赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量的影響

劉曉燕，張小月，阿卜杜喀依爾·阿卜杜艾尼，曲一鳴，閔海東，李學文*

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)2(圣元國際北京營養研究院，北京，101125)

新疆地區屬于干旱和半干旱型氣候區域，具有光照充足、晝夜溫差大的自然特點，因此釀酒葡萄長勢強、產量高、品質好、含糖量高，但酸度較低[1]，而酸度作為葡萄酒感官品質的重要組成部分，會對葡萄酒的風味、味道、顏色和香氣等產生影響，葡萄酒中常見酸有酒石酸、蘋果酸、檸檬酸，以及發酵過程中產生的乳酸、乙酸、琥珀酸[2]。增加葡萄酒酸度通常有化學增酸、離子交換法增酸和生物法增酸，其中生物增酸主要是利用產酸型非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵增加酸度[3-4]，混合發酵還對葡萄酒香氣的提升具有貢獻作用[5-6]，隨著非釀酒酵母逐漸被人們所接受，可將其應用于葡萄酒的初期發酵和其他果酒的發酵來改善酒的風味物質組成，如增加甘油、總酸、揮發性酯類含量，降低乙酸含量，形成穩定的吡喃花青素等，進而改善酒的整體品質[7-9]。

根據國際葡萄與葡萄酒組織(Organisation Internationale de la vigne et du Vin, OIV)統計，2019年中國葡萄酒產量83萬t，產生廢棄酒泥約1.7～2.6萬t，酒泥富含酒石酸鹽、蛋白質、多糖、多酚等物質，化學需氧量非常高且具有很高的生物降解性，直接排放污染環境，也浪費生物資源[10]。酒泥陳釀是葡萄酒釀造工藝中一種新興技術，葡萄酒在發酵結束后與酒泥接觸一定時間，在酶作用下生成酵母自溶物[11]，其主要是由微生物(主要是酵母菌)以及少量的酒石酸和無機鹽組成的[12]，通過酒泥中的酵母細胞吸附毒枝菌素，減少了氧化的可能和香氣的損失[13]，同時改善葡萄酒的穩定性[14]。適當的酒泥陳釀可以增加葡萄酒的圓潤度和結構感[15-16]。酵母自溶是一個非常緩慢的過程，添加某些富含β-葡聚糖酶的專業酶制劑可以在一定程度上加速酵母的自溶，促進有益酵母多糖的釋放以縮短上市周期[17]，不同酵母菌發酵后獲得的酒泥所含有益物質存在明顯差異，因此將混菌發酵與酒泥陳釀結合改善葡萄酒品質與合理利用“廢棄物”具有一定的研究意義。

關于葡萄酒混菌發酵后酒泥陳釀中有機酸含量的研究相對較少，本試驗以實驗室自釀葡萄酒為原料，將其在混菌發酵后的酒泥上陳釀60 d，通過高效液相色譜法檢測葡萄酒中7種有機酸含量，分析添加非釀酒酵母混菌發酵后酒泥陳釀對干紅葡萄酒有機酸含量的影響，進而分析葡萄酒品質差異，以期為葡萄酒品質提升以及酵母、酒泥的選擇利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：赤霞珠葡萄含糖量(以還原糖計) 251.00 g/L，可滴定酸含量(以酒石酸計)5.25 g/L，2020年9月采自新疆天山北麓產區冰湖酒莊。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)MST、耐熱克魯維酵母(Kluyveromycesthermotolerans)CT10、布魯塞爾德克酵母(Dekkerabruxellensis)PL09、β-葡聚糖酶，上海鼎唐國際貿易有限公司；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)F33、酒酒球菌(Oenococcusoeni)，法國 Laffort公司。

酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸(色譜純，純度≥98%)，新疆寶信源柏生物技術有限公司；超純水實驗室自制；KH2PO4、磷酸(分析純)，天津市致遠化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，天津市北聯精細化學品開發有限公司。

1.2 儀器與設備

LE204E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；UPHW-III-90T超純水機，四川優普超純科技有限公司；SK8200B超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司；LC-20AB高效液相色譜儀、SPD-M20A紫外檢測器、色譜數據處理系統、自動進樣器、柱溫箱，日本島津；3H16RI智能高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 色譜條件

參照王燕等[18]的方法，略做修改。色譜柱：Athena C18-WP(120 A，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：含1%甲醇(體積分數)和0.02 mol/L KH2PO4溶液，磷酸調pH 2.8；等度洗脫；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；λ=210 nm。

1.4 標準溶液的配制

分別稱取標準品L-酒石酸、丙酮酸、L-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸10 mg，用流動相溶解定容至10 mL，得到各標準品含量為1 mg/mL的混合標準溶液，按梯度稀釋為所需濃度，于4 ℃下保存備用。

1.5 葡萄酒的釀造與處理

1.5.1 赤霞珠干紅葡萄酒的釀造與酒泥陳釀處理

赤霞珠釀酒葡萄去除雜質，除梗破碎后入60 L不銹鋼桶(裝罐量約80%)，添加SO2(30 mg/L)，分別接入活化好的非釀酒酵母CT10、PL09，每隔5 h進行1次循環操作，48 h后分別接入活化好的釀酒酵母MST、F33，即CT10與MST(CM)順序接種，PL09與F33(PF)順序接種進行常溫(22～24 ℃)發酵，酒精發酵結束后接入乳酸菌啟動蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation, MLF)(18～20 ℃)，發酵結束后添加SO2(60 mg/L)終止發酵，去除皮渣，分別對葡萄酒進行體積比4∶1的酒泥陳釀，另設添加富含β-葡聚糖酶液(酶活力30 000 U/mL，添加量50 mL/t)處理組促進酒泥自溶，不添加酒泥為對照組，60 d后分離酒泥取樣分析。具體分組見表1。

表1 試驗處理Table 1 Test treatments

1.5.2 待測樣品處理

參照馬旭藝等[19]的方法，12 000 r/min、4 ℃冷凍離心15 min后超聲，經0.45 μm濾膜過濾，用流動相稀釋后進樣分析。

1.6 數據處理

通過Excel 2010進行數據統計，利用SPSS 20.0對數據進行顯著性分析，應用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 有機酸標準曲線制作

以7種有機酸的混合標準液的6種不同濃度為x，在上述試驗條件下檢測分析得到相應的峰面積y，做線性回歸處理后得到表2所示的線性方程，7種有機酸的相關系數為0.999 1～1.000 0，線性關系良好，以3倍性噪比計算樣品的檢出限為 0.171 6～2.835 5 mg/L。7種有機酸標準品及葡萄酒樣品中相應酸的高效液相色譜圖見圖1。

2.2 方法回收率與精密度

由表3可知7種有機酸的平均回收率為95.82%～100.79%，相對標準偏差小于1.31%，準確度與精密度滿足本試驗所需要求。

表2 七種有機酸標準品回歸方程與檢出限Table 2 Regression equation and detection limit of 7 kinds of organic acid standard products

a-有機酸標準品；b-葡萄酒樣品1-酒石酸；2-丙酮酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-乙酸；6-檸檬酸；7-琥珀酸圖1 有機酸標準品和葡萄酒樣品有機酸高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of standards and organic acids in wine samples

表3 添加質量濃度、回收率與精密度Table 3 Concentration, recovery rate and precision of the method

2.3 不同處理對赤霞珠干紅葡萄酒中有機酸含量的影響

2.3.1 混菌發酵對赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量的影響

如圖2所示，混菌發酵對酒樣中丙酮酸含量有積極作用，其中PF-1顯著高于MST-1，且PF-1即混菌發酵消耗了更多的蘋果酸，而產生了更多的乳酸，CM-1比MST-1增加12.66%，PF-1比F33-1增加16.07%(P<0.05)，混菌發酵比單一釀酒酵母發酵產生了更多的乙酸(P<0.05)，其中CM-1酒石酸含量比MST-1增加11.17%(P<0.05)，整體而言，混菌發酵對赤霞珠干紅葡萄酒中有機酸總量有積極影響，CM-1比MST-1增加13.02%，PF-1比F33-1增加5.37%，由此也體現出增酸非釀酒酵母CT10增酸作用明顯，顯著高于其他處理組(P<0.05)。

圖2 混菌發酵赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量Fig.2 Organic acid content of mixed fermentation Cabernet Sauvignon dry red wines注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3.2 混菌發酵后酒泥陳釀對赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量的影響

如圖3所示，經酒泥陳釀后丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸含量出現下降現象，其中PF-2琥珀酸含量比F33-2降低14.18%(P<0.05)，PF-2比F33-2乙酸含量高出32.43%，在酒泥陳釀過程中保持上升的有相對含量較高的乳酸和酒石酸，其中CM-2比MST-2的乳酸含量增加5.58%，PF-2比F33-2的乳酸含量增加19.18%，酒石酸含量增加7.06%(P<0.05)，酒泥陳釀后葡萄酒中7種有機酸總量有顯著性差異，其中PF-2總含量最高，比F33-2高出10.52%(P<0.05)，而CM-2與MST-2無顯著差異。

圖3 酵母酒泥陳釀赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量Fig.3 Organic acid content of Cabernet Sauvignon dry red wines aged in yeast mash

2.3.3 混菌發酵后酒泥陳釀結合β-葡聚糖酶處理對赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量的影響

如圖4所示，丙酮酸含量下降，最終F33-3含量最高；CM-3蘋果酸含量比MST-3下降了28.57%，檸檬酸含量降低23.40%，乙酸含量比MST-3高出14.81%，PF-3比F33-3高出32.47%，琥珀酸含量降低，其中F33-3含量最高，乳酸含量在陳釀后增加，CM-3比MST-3增加9.92%，PF-3比F33-3增加16.25%，同樣保持增加的有酒石酸，其中PF-3比F33-3增加4.66%(P<0.05)。添加β-葡聚糖酶的變化規律與酒泥陳釀相似，但差異更顯著，說明在β-葡聚糖酶的作用下，葡萄酒中有機酸的含量及構成發生變化。

圖4 酵母酒泥結合β-葡聚糖酶處理赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量Fig.4 Organic acid content of Cabernet Sauvignon dry red wines treated by yeast mash combined with β-glucanase

2.3.4 各處理對赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量影響的比較

如表4所示，混菌發酵后不同酒泥陳釀結合β-葡聚糖酶處理對葡萄酒中酒石酸含量有顯著影響，檢測結果顯示其在7種有機酸中含量最高，約占總含量的38.59%～43.47%，樣品處理中酒石酸含量MST-3>MST-2>MST-1，而CM-1酒石酸含量顯著高于CM-2和CM-3，且CM-3>CM-2，酵母F33各處理組中酒石酸含量為F33-2>F33-3>F33-1，PF混菌酒泥陳釀處理則與之有相同規律，且顯著高于F33各處理，酒泥陳釀可以保留葡萄酒中更多的酒石酸，特別是添加β-葡聚糖酶處理?；炀l酵可提升丙酮酸含量，PF-1顯著高于F33-1，釀酒酵母酒泥陳釀后丙酮酸含量增加，F33-2、F33-3比F33-1顯著提升(P<0.05)。陳釀后蘋果酸含量出現下降?；炀l酵和酒泥陳釀均可產生更多的乳酸，MST-2、MST-3比MST-1提升5.90%、5.05%，MST與CT10混菌發酵與酒泥陳釀后乳酸含量可增加5.58%～12.66%，F33與PL09混菌發酵與酒泥陳釀后乳酸含量可增加16.07%～19.18%，由此可以看出混菌酒泥陳釀比單一釀酒酵母酒泥陳釀產生乳酸的效果更加顯著，β-葡聚糖酶的添加促進了這種現象。經過混菌酒泥陳釀后酒樣乙酸含量下降，CM-2比CM-1下降15.47%，PF-2比PF-1下降6.33%(P<0.05)，說明酒泥陳釀能夠吸附葡萄酒中的醋酸菌，改善葡萄酒品質；CM-1比MST-1檸檬酸含量高出28.57%，而PF-1與F33-1檸檬酸含量一致，這可能是CT10增酸所引起的現象，而通過酒泥陳釀和β-葡聚糖酶處理后，檸檬酸含量均有小幅提升，但CM處理出現下降現象且差異顯著(P<0.05)?；炀l酵降低了琥珀酸含量，CM-1比MST-1減少10.08%，PF-1比F33-1減少11.45%，經β-葡聚糖酶處理后琥珀酸含量升高5.69%～23.84%，其中F33-3與F33-1提升23.84%差異顯著(P<0.05)?；炀l酵增加了有機酸總含量，CM-1比MST-1提升13.02%，PF-1比F33-1提升5.37%；酒泥陳釀處理中MST-2比MST-1增加6.73%，CM-2比MST-1總酸含量增加6.62%(P<0.05)，PF-2比PF-1增加4.73%，PF-2比F33-2增加10.52%，比F33-1增加12.53%(P<0.05)；酒泥陳釀結合β-葡聚糖酶處理中MST-3比MST-2、MST-1分別增加3.84%、10.31%，CM-3比MST-1總酸含量增加10.53%(P<0.05)，F33-3比F33-2、F33-1分別增加6.08%、8.19%，比PF-1增加7.67%，PF-3比F33-3增加4.84%，比F33-1增加12.63%(P<0.05)。

3 討論與結論

有機酸是葡萄酒結構的重要組成部分，其中酒石酸是葡萄酒中呈酸澀味的特有有機酸[20]，在7種有機酸中含量最高，本研究結果顯示混菌發酵可提高酒石酸含量，在此基礎上進行酒泥陳釀、添加β-葡聚糖酶處理效果更加明顯，這是因為酒泥降解產生的多糖限制了葡萄酒中酒石酸的沉淀[21]，且酒石酸具有抗分解作用，很少受到葡萄酒微生物的攻擊，因此釀酒師在葡萄醪中添加較穩定的酒石酸[22]。樣品中混菌發酵、釀酒酵母酒泥陳釀后可增加丙酮酸含量，研究發現，混合發酵能夠有效促進葡萄糖苷特定前體物丙酮酸、乙醛等產量的增加[23]，因此能夠提高穩定色素的葡萄糖苷的合成[24]；而混菌發酵酒泥陳釀以及β-葡聚糖酶處理后丙酮酸含量減少，在葡萄酒老化過程中，丙酮酸的減少可能是由于形成了其他化合物。吡喃花青素色素在花青素結構上顯示出一個額外的吡喃環，被鑒定為丙酮酸親核加成的結果[25]，而丙酮酸是乳酸菌代謝的產物，也可由蘋果酸和乳酸氧化產生[26]。蘋果酸在葡萄中以及酒精發酵結束時含量較多，而經過MLF后含量逐漸減少，MLF是大多數葡萄酒生產中重要的二次發酵，通常由乳酸菌在酒精發酵完成之后進行，將尖銳的L-蘋果酸轉化為柔和的L-乳酸，通過乳酸菌殘留的營養物質提高微生物的穩定性，可促進葡萄酒在乳酸菌次級代謝中的感官調節[27]，樣品中混菌發酵、酒泥陳釀以及結合β-葡聚糖酶處理可以依次提升葡萄酒中乳酸含量，這種現象可以使葡萄酒的口感更加圓潤[20]。乙酸含量過高則會嚴重影響葡萄酒的品質[28]，而檢測結果顯示混菌發酵和釀酒酵母酒泥陳釀均會引起乙酸的增加，前者可能是因為發酵初期非釀酒酵母發酵能力弱[29]所引起的，混菌酒泥陳釀與結合β-葡聚糖酶處理均使乙酸含量下降，說明酒泥自溶過程中吸附了對葡萄酒有消極影響的醋酸菌，能夠改善葡萄酒品質。檸檬酸是三羧酸循環的中間產物[20]，可以溶解Fe3+形成可溶性絡合物，可防止葡萄酒的鐵破敗病，在酒精發酵過程會產生少量檸檬酸，MLF過程中乳酸菌則會消耗檸檬酸產生乙酸、乙偶姻和CO2等[30]。研究結果顯示，與增酸非釀酒酵母CT10混合發酵可提升檸檬酸含量，但其含量經過酒泥陳釀后減少，而與增香非釀酒酵母PL09混合發酵則呈相反變化。琥珀酸是糖在葡萄酒發酵過程中產生的副產品，會使葡萄酒的味道有咸味、苦味和酸味[28]，試驗結果顯示酒泥陳釀以及結合β-葡聚糖酶處理后琥珀酸含量升高，且與增酸非釀酒酵母結合處理的效果更顯著，高水平的脈沖電場老化葡萄酒時使琥珀酸二乙酯水解，琥珀酸含量升高[22]，酒泥陳釀過程中可能也發生了這樣的反應。酒泥陳釀處理中除CM處理外，其他各組經酒泥陳釀后總酸含量均增加了2.25%～7.57%，添加β-葡聚糖酶的處理組增加更為明顯，增幅達到7.67%～10.31%。綜上，混菌發酵與酒泥陳釀有利于葡萄酒中總酸含量的提升，β-葡聚糖酶的添加使這種現象更加明顯，史紅梅等[11]發現貴人香葡萄酒經酒泥陳釀后有機酸總量提升，與本研究結果相似。

此外，酒泥陳釀過程中酵母發生自溶現象，細胞膜破裂內溶物被釋放產生核苷、核苷酸、氨基酸、肽、葡聚糖、甘露糖蛋白等，增加葡萄酒的結構感和圓潤度，提高澄清度[12]；葡萄酒存在顏色褪色快的問題，史紅梅等[31]利用不同酵母酒泥陳釀提高了蛇龍珠葡萄酒的顏色指標，增強顏色的穩定性。葡萄酒中農藥殘留問題是影響葡萄酒品質和健康的一大因素，酒泥陳釀過程中吸附農藥，大幅降低殘留量，改善葡萄酒的香氣物質，李明月等[15]研究發現帶細酒泥陳釀對紅提葡萄酒風味有一定的積極影響。MAZA等[16]發現酒泥陳釀可降低葡萄酒澀感、軟化單寧，從而達到修飾口感的作用。但是酒泥自溶速度較慢，陳釀工藝把控不好會出現葡萄酒感染雜菌、產生不愉快的酒糟味等問題，因此在加速酒泥自溶速度的研究中出現多種解決方法，例如超聲、脈沖電場、商業甘露糖蛋白代替等[16]，但都存在經濟或實際條件限制的問題，還需進一步研究尋找較好的解決方法和符合實際的推廣技術。

本研究通過釀酒酵母MST、F33分別與增酸非釀酒酵母CT10、增香非釀酒酵母PL09混菌發酵后進行酒泥陳釀，并添加β-葡聚糖酶促進酒泥自溶，采用高效液相色譜法檢測樣品中7種有機酸含量，結果顯示混菌發酵與酒泥陳釀均對葡萄酒中有機酸含量有提升作用，其中酒石酸、乳酸、乙酸以及總酸的變化差異性較為顯著，與CT10混釀后酒泥陳釀在β-葡聚糖酶的作用下，會更有利于有機酸的保留與產生，與PL09混菌發酵后酒泥陳釀可以使有機酸生成的代謝活動加強，使其含量增加；釀酒酵母酒泥陳釀后，有機酸總量增加，與混菌發酵酒泥陳釀的差異性減小，說明酒泥陳釀可以使葡萄酒中的物質發生變化，促進有機酸的產生，使葡萄酒口感平衡，達到增酸的目的，因此合理利用混菌發酵后的酒泥結合β-葡聚糖酶處理進行陳釀對葡萄酒有機酸的提升效果顯著，具有一定的應用價值。