第一例栽培種花生花藥培養單倍體植株的創制

謝永平，鄭運歡，郭英鐸，陳肇聰

（汕頭市農業科學研究所，廣東 汕頭，515041）

花生（Arachis hypogaeaL.），是世界上重要的經濟和油料作物。目前花生特異種質資源的匱乏成為其育種的瓶頸，因此種質的創新工作成為花生育種中亟待解決的問題[1]。

花藥培養是20 世紀60 年代以來發展起來的一項生物技術，旨在誘導出單倍體花粉植株?；ㄋ幣囵B屬于器官培養范疇，是把發育到一定階段的花藥接種到人工培養基上，誘導小孢子由正常的配子體發育途徑轉向孢子體發育途徑，而后通過愈傷組織或胚狀體再生單倍體植株的過程[2]?；ㄋ幣囵B對于基礎和育種研究都有重大意義，用雜種一代（F1）的花藥進行培養，育出的單倍體使染色體加倍，得到純合的個體，易于鑒定和選擇，省時省工，大大提高選種效率[3]。利用花藥培養產生單倍體植株的技術，已被廣泛應用到28 科68 屬170 多種植物上，其中23 科52 屬約300 種高等植物的花藥培養獲得成功?；ㄋ幣囵B技術在植物育種上具有縮短育種年限、提高育種效率、創建新種質資源等優點?；ㄉㄋ幣囵B研究最早報道始于1981 年，Bajaj 等用A.hypogaea和A.glabrata及A.villosa的單核后期的花藥為外植體，經愈傷組織獲得少量再生植株[4]。國內花生花藥培養研究始于20 世紀70 年代初，但一直處于條件摸索和優化階段，袁美等較系統地研究了基本培養基、基因型和蔗糖濃度等因素在花生花藥愈傷組織誘導中的作用，以及幾種激素組合在誘導愈傷組織及分化形成體胚中的作用[5]；張景景等對不同發育時期的花藥進行固體培養，對誘導愈傷和愈傷分化的培養基進行了篩選[6]；但兩項研究均未獲得完整再生植株。

本研究以栽培種花生為材料，在花生單倍體育種工作進行前沿性探索試驗。自2017 年3 月開始，通過比較滅菌時間、誘導培養基、分化培養基、再生培養基和植株再生培養條件等試驗，篩選較為適合花生的花藥愈傷組織誘導及分化培養基、植株再生培養條件，同時，對再生植株進行染色體數目鑒定，探討橋梁品種對再生植株創制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

所用花生材料見表1。2017 年3 月，在汕頭市農業科學研究所官塘基地種植F3株系50份，在汕頭市農業科學研究所花生育種基地種植F1組合14個，共64 份材料；5 月選取健康花生植株摘取未開放花蕾，花蕾淡綠色，花蕾規格約0.5 cm～0.7 cm，約在小孢子單核靠邊期，每個株系（組合）取3～5 個花蕾。

表1 供試材料Table 1 Peanut materials used in the study

摘取花蕾次日，花蕾先用自來水沖洗20 min，在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡30 s，接著放入1%NaClO（每100 mL 消毒液加1～2 滴表面活性劑Twenn-20）中消毒，設置三個處理時間：分別為7 min、9 min、11 min，然后用無菌水沖洗5～6 次，最后置于滅菌濾紙上吸干表面水分，剪除萼片，將花藥塊從花蕾中擠壓出來，剔除花瓣、花柱。

1.2 愈傷組織誘導培養

設置誘導培養基4 種，分別為B5D1、B3D1、B5N1、B3N1（表2），培養基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH 5.5～5.8。使用直徑5 cm 廣口玻璃瓶，每瓶倒入愈傷組織誘導培養基30 mL，經高壓濕熱滅菌、冷凝后接入已經消毒滅菌處理的花藥，溫度26±2℃黑暗培養20 d，統計花藥的污染數、死亡數和愈傷組織數。

表2 愈傷組織誘導培養基Tabel 2 Media for calli induction

愈傷組織誘導率=（產生愈傷組織花藥數/接種花藥數）×100%

1.3 愈傷組織分化培養

設置分化培養基3 種，分別為B5N1-1、B5N1-2、B5N1-3（表3），培養基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH 5.5～5.8。使用直徑5 cm 廣口玻璃瓶，每瓶倒入培養基30 mL，經高壓濕熱滅菌、冷凝后接入嫩綠色的愈傷組織，置于溫度26±2℃、光照（2000 lux）8 h/d環境下培養30 d，統計愈傷組織分化率。

表3 分化培養基Tabel 3 Media for shoot induction

愈傷組織分化率=（能分化出幼芽的愈傷組織塊數/轉移愈傷組織塊數）×100%

1.4 植株再生培養

將已分化出根、莖、葉的幼苗（高約4～6 cm，具有2～3 節間）接入CM 培養基、SG 培養基（表4，包含蔗糖20 g/L、瓊脂5.5 g/L，pH 5.5～5.8），置于溫度26±2℃、光照（2800 lux）10 h/d 光照培養箱中培養，15 d后記錄再生苗的根數和葉數、再生植株數量。

表4 再生苗培養基Tabel 4 Media for intact plant regeneration

再生苗率=（再生苗數/接種已分化出幼芽的愈傷組織塊數）×100%

再生植株率=（完整再生植株數/接種已分化出幼芽的愈傷組織塊數）×100%

1.5 煉苗移栽

2018 年9 月，將兩株再生植株（編號：15B8-6）帶玻璃瓶放入煉苗棚進行自然光照培養30 d，株高約7～8 cm、莖基直徑約0.2 cm、根5條或以上的小苗洗凈晾干，置入1.5 寸（栽培基質為細沙∶珍珠巖=1∶1）塑料杯中，28±2℃、75%遮蔭自然光下栽培。

2020 年10 月，以汕油121 為砧木、以再生植株（編號15B8-8）為接穗，嫁接部位為上胚軸，嫁接后用薄膜封閉并保持高濕度管理33 d，撤除薄膜煉苗15 d，嫁接成活后移植至田間，并搭建小拱棚覆蓋薄膜保溫栽培。

1.6 染色體鑒定方法

2020年11月，委托河南省作物分子育種研究院進行花生花藥培養植株（編號：15B8-8）的染色體數目鑒定。

（1）花生根尖前處理：將根長1～1.5 cm 的主根及側根根尖，放置于2 mmol/L 8-羥基喹啉（配置方法：0.029 g 8-羥基喹啉加入100 mL蒸餾水）中25°C處理3 h；將根尖取出用乙醇-冰醋酸（3:1）固定液（配置方法：30 mL 乙醇:10 mL 冰醋酸）進行固定，置于室溫下約6 h后置于-20°C冰箱保存約12 h。

（2）染色體制片：采用根尖壓片法。

（3）熒光原位雜交染色：花生A 和B 基因組特異探針[7]，A 基因組標記綠色，B 基因組標記紅色；利用A 和B 基因組特異探針對15B8-8 根尖染色體進行熒光原位雜交染色。

（4）圖片獲取及分析：利用高分辨率熒光正置顯微鏡對雜交后片子照相，圖片處理和染色體分析。

1.7 數據分析

采用Excel軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒時間對污染率、死亡率和誘導率的影響

花蕾經過1% NaClO 消毒處理，花藥培養20 d后，出現三種情形：污染、死亡、誘導形成愈傷組織。由表5 可知，滅菌時間為7 min 時，污染率最高（11.5%）；消毒時間為9 min，死亡率降低、誘導率最高；消毒時間為11 min 時，污染率最低、死亡率最高、誘導率最低。因此，花藥的消毒時間對愈傷組織誘導率有著較大影響，綜合來看，1% NaClO 消毒時間9 min效果較好。

表5 外植體消毒時間對花藥污染率、死亡率和愈傷誘導率的影響Table 5 Effect of disinfection period on rate of contamination，death and calli induction of anthers

2.2 誘導培養基對愈傷組織誘導率的影響

花藥經過培養20 d 后（圖1A），統計愈傷組織數。由表6 可知，B5N1、B3N1 培養基上的愈傷組織誘導率較高，分別達到81.3%、77.3%。因此B5N1、B3N1 培養基較B5D1、B3D1 培養基更適合花生花藥誘導培養。

表6 誘導培養基對愈傷組織誘導率的影響Table 6 Effect of induction media on rate of calli induction

圖1 愈傷組織誘導（A）和幼芽形成（B）Fig.1 Calli induction(A)and shoot formation(B)

2.3 分化培養基對芽分化的影響

愈傷組織接入B5N1-1、B5N1-2、B5N1-3培養基培養30 d 后調查分化率。由表7 可知，B5N1-2 培養基上的愈傷組織分化帶幼芽組織數量較多（圖1B），達到6個，分化率達4.26%，葉片和根形態更為明顯、完整，較為適合花生花藥愈傷組織再分化培養。

表7 分化培養基對分化率的影響Table 7 Effect of differation media on rate of shoot induction

2.4 再生培養基對再生苗生長的影響

將已分化出幼芽的愈傷組織塊接入CM 培養基、SG培養基15 d后，少數能繼續生根生葉，且根葉形態趨于正常（圖2）。由表8可知，兩種培養基上的再生苗根數、葉數差異很小，SG 培養基的再生苗全部出根，CM 培養基的再生苗出現了有葉無根的不良生長效果，因此，SG培養基比CM培養基更適合再生苗根葉生長。

圖2 再生植株生長情況Fig.2 Status of regenerated plants

表8 再生培養基對再生苗生長的影響Table 8 Effect of regeneration media on growth of shoots

2.5 外植體世代對再生植株創制的影響

由表9 可知，試驗共培養64 份材料，其中F1世代有14份，F3世代有50份材料。F1世代材料的愈傷組織誘導率為69.8%，芽分化率為2.27%，獲得再生苗1株，無再生植株，再生苗率和再生植株率分別為50%、0；F3世代材料的愈傷組織誘導率為70.7%，芽分化率為2.99%，獲得再生苗5 株、再生植株4 株，再生苗率和再生植株率分別為50%、40%。綜上所述，在愈傷組織誘導、芽分化和再生苗方面，F1世代與F3世代之間差異很??；從F1世代只獲得1 株再生苗，與F3世代比較再生植株率，由于樣本太小存在較大誤差，不具備可比性。

表9 供體植株世代對再生植株創制的影響Table 9 Effect of generation of donor plants on establishment of plant regeneration

2.6 基因型對再生植株創制的影響

由表10 可知，試驗共有64 個株系（組合）進行花藥培養，其中有23 個株系（組合）親本包含汕油52，愈傷組織誘導率69.2%、芽分化率5.56%，獲得再生苗5 株、再生植株4 株，再生苗率71.4%、再生植株率57.1%；另外，有41 個株系（組合）親本未包含汕油52，愈傷組織誘導率71.1%、芽分化率1.68%，獲得再生苗1 株、再生植株0 株，再生苗率20.0%、再生植株率為0。

表10 基因型對再生植株率的影響Table 10 Effect of genotype on rate of plant regeneration

由表11 可知，試驗獲得再生苗6 株，其中株系15B5-7、15B8-6、15B8-8 分別為1 株、2 株、2 株，組合16B13 為1 株；獲得再生植株4 株，15B8-6、15B8-8 等二個株系各2 株。其余株系（組合）的花藥愈傷組織均未出現分化。獲得再生苗的4個株系（組合）中3 個株系（組合）的親本包含汕油52；有2 個株系獲得再生植株，均為15B8 組合（粵油256/汕油52）F3世代株系，汕油52是父本。

表11 再生植株的統計Table 11 Description of regenerated plants

綜合對比可以發現，汕油52 花生品種，無論是作為父本、母本，世代數在F1、F3，都具有較強的花藥培養力。

2.7 移栽結果

2018 年移栽過程中，由于環境變化劇烈導致2株再生植株（編號15B8-6）死亡；2020 年嫁接成活后，1 株再生植株（編號15B8-8）成功移植田間栽培（圖3）。

圖3 再生苗的嫁接（A）、煉苗（B）和田間移植（C）Fig.3 Grafting(A),acclimation(B)and transplanting(C)of regeneration shoot

2.8 染色體鑒定結果

結果如圖4。依據熒光原位雜交染色結果可以看出，花生花藥培養材料染色體總數為20，A基因組（綠色）染色體條數為9，B基因組（紅色）染色體條數為11條?；ㄉ耘喾N染色體條數為40，與栽培種相比較來看，該材料為單倍體。

圖4 花藥單株的倍性鑒定FISH檢測圖：有絲分裂中期（A）和前期（B）Fig.4 Haploid identification of plants from anther culture by FISH:metaphase(A)and prophase(B)of mitosis

3 討論

Mroginski 和Ternandez 在1980 年曾報道用花藥培養得到兩個二倍體野生種幼苗，但在花生栽培種上尚未見成功的報道［8］。國內有關花生花藥培養的報道極少，只有山東省花生研究所的袁美等與河北農業大學的張景景等進行過研究報道，但均未獲得完整再生植株[5，6]，2012 年以來，國內未見花生花藥培養的報道。由此看來,由花生花藥培養獲得單倍體植株十分困難[5]。

本研究中，花生花藥愈傷組織誘導率為56.0%～81.3%，愈傷組織分化率為1.42%～4.26%，再生苗率20.0%～100%，再生植株率0%～100%。綜合來看，1%NaClO 消毒滅菌時間9 min，誘導培養采用B5N1、B3N1 培養基，分化培養采用B5N1-2 培養基，再生苗生長采用SG 培養基，從接種花藥到獲得再生植株，成功的概率為0.67%。

編號為15B8-8（F3）的再生植株，經根尖染色體鑒定，具有9 條A 染色體、11 條B 染色體，而不是理論上的10 條A 染色體、10 條B 染色體，推測分裂期間可能進行了染色體交換，確切原因尚有待進一步探討。此外，由于完整再生植株數量極少，暫時沒有條件做其他染色體鑒定方法，待植株擴繁足夠多，可以采用細胞流氏儀進行倍性鑒定。

需要說明的是，本研究自2017 年3 月開始，進行多次花生花藥培養，除了2017年春季試驗獲得完整再生植株，其他試驗均沒有獲得再生植株，花生花藥培養技術體系仍不完善，還需進一步優化。究其原因，一是后來的試驗取樣共50 朵花蕾左右，規模太??；二是課題組沒有專職試驗人員，無法長期堅持高強度研究；三是卡在最為關鍵的再分化培養環節。

在花藥培養力較強的基因型上，花藥培養方法具有許多優點，包括手續簡便、效率高和集約化等。某一特定的品種，它本身的花粉植株的誘導率并不高，但是當它作為雜交親本之一時，雜種一代的花粉愈傷組織的誘導率都相當高，這樣的品種通常稱為花藥培養的“橋梁品種”[9]。

綜合對比可以發現，汕油52 花生品種，無論是作為父本、母本，世代數在F1、F3，都具有較強的花藥培養力，因為只有一次試驗，能否成為花生花藥培養的“橋梁品種”，尚有待進一步探討。

移栽過程中，由于環境變化劇烈導致15B8-6的兩株完整再生植株死亡，未能開展后續研究。此后，課題組采用嫁接的方法，15B8-8 單倍體植株成功移栽在室外。

4 結論

此次研究在花生花藥培養方面取得突破性進展，首次在花生學科領域花生栽培種上獲得單倍體植株，編號為15B8-8 的完整再生植株，經根尖染色體鑒定，具有9 條A 染色體、11 條B 染色體，是第一例栽培種花生花藥培養單倍體植株。利用花藥培養單倍體植株構建成的DH 群體，是遺傳連鎖圖譜構建和進行QTL 定位等方面研究的理想群體，可以為花生基因定位和功能基因的發掘奠定物質基礎，為花生研究與育種提供了新的思路和途徑。

致謝：感謝山東花生研究所袁美博士在文章修改和倍性鑒定方面的指導、感謝汕頭大學鐘名其博士在培養基選擇方面的指導、感謝河南省作物分子育種研究院杜培博士在倍性鑒定方面的協助！