脫落酸處理對油菜幼苗鎘積累和毒害作用的影響

余燕，張藝舜，李瑞，賀原，趙雪，汪華志，張付貴，朱宗河，周可金

（安徽農業大學農學院，安徽合肥，230036）

鎘（cadmium，Cd）是生物毒性最強的重金屬元素之一，具有致病、致癌和致突變的作用。隨著工業、城市和農村的快速發展，我國農田土壤Cd 污染形勢日益嚴峻。據統計，我國Cd污染土壤面積已達20 萬公頃，約占耕地面積的20%[1,2]?！度珖寥牢廴緺顩r調查公報》顯示，我國耕地Cd 污染點位超標率最高（7.0%），為首要污染物。除了具有一般重金屬污染的共性外，Cd 還具有移動性強、毒性高和降解難等特點[3,4]。土壤Cd 污染不僅會引起土壤功能退化和作物生長受阻導致減產，還容易被農作物吸收，在食物鏈富集，危害動物和人體健康[3,5,6]。油菜（Brassica napusL.）是我國廣泛種植的油料作物，是植物油脂和蛋白的重要來源。此外，油菜還具有蔬用、飼用、肥用、蜜用和花用等多種功能，其多功能開發利用近年來得到了大量的探索，并集成了一批高效的開發模式[7,8]。但是油菜具有較強的Cd 吸收積累能力，而油蔬兩用的油菜常種植在城鄉結合部中輕度污染農田土壤中，其生產面臨著較大的Cd污染風險[9]。因此，亟需開展緩解油菜Cd 毒害及減少可食部位Cd積累的調控方法及其機理研究。

應用化學調控物質是緩解作物Cd 毒害以及植株Cd 積累的一種經濟有效的栽培管理措施[10～13]。脫落酸（abscisic acid，ABA）是植物體內一種重要的激素物質，研究發現其不僅對植物的生長發育過程有調節作用，也參與了植物對逆境脅迫，包括Cd 脅迫的響應過程[12]。例如，在水稻葉片[14]、西紅柿塊莖[15]、柑橘[16]和香蒲[17]等植物中研究發現，Cd 處理能夠增加植物內源ABA 的含量。在水稻中進一步的研究發現，Cd 調節的ABA 含量變化與稻秧的耐Cd性呈正相關關系[14]。外源應用ABA 可顯著緩解Cd對擬南芥[10]、綠豆[18]、水稻[19]、小麥[20]等的毒害，促進植株的生長，提高生物量，降低植株新葉的萎黃程度。然而，ABA 處理對于Cd 脅迫下油菜耐Cd 性的影響及其調控機理尚不清楚。

因此，本研究以南方主栽的甘藍型油菜灃油737 為材料，通過水培試驗，探究外源ABA 處理對Cd 脅迫下油菜幼苗的干鮮重、根系形態等農藝性狀，根系活力、丙二醛以及活性氧等損傷生理指標，以及抗氧化酶活性和Cd 含量等的影響，以期闡明ABA處理對油菜Cd毒害作用的影響及其作用機理，為實現增強作物耐Cd 性和可食部位安全性的生產調控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

甘藍型油菜品種灃油737，購買于陜西榮華農業科技有限公司。脫落酸（ABA，分析純）購買于阿拉丁試劑公司。選取飽滿均勻的油菜種子用1%的NaClO 消毒、浸種12 h 后移至鋪有六層紗布的發芽盒中催芽12 h，待種子露白后播于盛有1/4 Hoagland營養液（pH 5.5）的方形塑料盆中。出苗后，選擇大小一致的幼苗移植到盛有1/2 Hoagland 營養液（pH 5.5）的黑色塑料燒杯中繼續培養一周，之后將營養液更換為完全Hoagland 營養液（pH 5.5）培養一周，然后選取長勢一致的幼苗添加不同的試劑處理一周后取樣待測。營養液每四天更換一次。完全營養 液 主 要 由1 mmol/L CaCl2，3 mmol/L KNO3，1 mmol/L NaH2PO4，0.5 mmol/L MgSO4，50 μmol/L Fe-EDTA， 0.5μmol/L ZnSO4， 0.1μmol/L（NH4）6Mo7O24，0.1 μmol/L CuSO4，0.5 μmol/L MnSO4和10 μmol/L H3BO3。人工氣候箱的環境相對濕度75%，溫度24℃/18℃（晝/夜），光周期為晝/夜16 h/8 h，光強度14 400 lx。

試驗于氣候箱中采用水培方式進行，采用完全隨機區組設計，每個處理設置3組生物學重復，每組6棵幼苗。鎘（Cd）處理濃度分別為：5、10、20、30、40μmol/L，采用CdCl2配置母液加入營養液中，隨后用HCl 和NaOH 調 節pH 至5.5±0.1。ABA 濃 度 分 別為：5、10、15、20、30μmol/L，具體試驗處理設置見表1。處理1 周后，取樣進行農藝性狀的測定，篩選出適宜的Cd 處理濃度和ABA 處理濃度。然后，設置對照（CK）、鎘處理（20 μmol/L Cd）、ABA+Cd（15μmol/L ABA+20 μmol/L Cd）三 個 處 理 繼 續 后 續試驗。

表1 試驗處理Table 1 Abbreviation and name of treatments

1.2 測定指標與方法

1.2.1 農藝性狀 處理一周后，將油菜植株按照地上部、根系分開取樣，洗凈擦干后稱取鮮重，隨后放入烘箱中105℃殺青30 min，并在80℃條件下烘干至恒重，稱取干重。同時，采用SPAD 型便攜式葉綠素測定儀（SPAD-502 Plus）進行測定SPAD 值。根系生長及形態采用根系掃描儀進行掃描，并用Win-RHIZO根系分析系統進行分析。

1.2.2 損傷生理指標 處理一周后，取幼苗的根系，參照陳瑛等[21]采用TTC 法測定根系活力。根系膜脂過氧化程度參照Yu 等[22]采用硫代巴比妥酸反應法測定MDA含量。

1.2.3 活性氧含量 取處理一周后的油菜幼苗根系洗凈測定過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2·-）含量，分別參照Yu等[22]通過硫酸鈦反應法和羥胺氧化法進行。

1.2.4 抗氧化酶活性 根系抗氧化酶活性的測定參照Yu等[23]的方法進行。幼苗處理一周后，取根系洗凈擦干稱鮮重，液氮研磨后加入50 mmol/L pH 7.0 的PBS 提取液（內含1 mmol/L EDTA 和1%的PVP），于12 000g 4℃下離心20 min 后保留上清液用于SOD、CAT 和POD 的測定。其中，超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）的測定采用氮藍四唑（nitro blue tetrazolium）光化還原法進行，以NBT 抑制50%光化還原為一個活性單位（U）計算SOD 酶活。過氧化氫酶（CAT，EC 1.11.1.6）活性通過測定反應液中H2O2的降解速率獲得，ε=39.4 (mol/L)-1cm-1。過氧化物酶（POD，EC 1.11.1.7）活性通過愈創木酚法進行測定，ε=26.6(mol/L)-1cm-1。

1.2.5 鎘含量 植株不同部位的Cd 含量參照Yu等[22]采用硝酸法硝化，通過電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）測定。同時計算Cd 轉運系數，公式如下：Cd轉運系數=Cd葉片/Cd根系。

1.3 數據分析

采用DPS 18.10 數據處理系統進行方差分析（ANOVA），處理間采用最小顯著差異法（LSD 法）比較差異顯著性（P＜0.05），采用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的Cd處理對油菜幼苗生長的影響

由表2 可見，Cd 處理會抑制油菜幼苗的生長，且抑制程度隨Cd 處理濃度的增加而加重。除低濃度（5μmol/L）下油菜幼苗根系的鮮重、干重與CK 相比差異不顯著外，油菜幼苗的地上部鮮重、干重以及根系活力均隨Cd處理濃度的增加而顯著下降（表2）。SPAD值則呈現隨Cd濃度的增加先降低后增加的趨勢，在20μmol/L Cd處理時下降最為厲害，僅為對照的55.04%，因此我們后續試驗選擇這一濃度進行處理。此時，油菜的地上部鮮重、根系鮮重、地上部干重、根系干重以及根系活力分別較對照下降了50.98%、38.88%、44.35%、20.64%、44.96% 和68.51%。

表2 不同濃度鎘處理對油菜幼苗生長的影響Table 2 Effects of different concentrations of Cd treatments on growth of rapeseed seedlings

2.2 不同濃度ABA 處理對Cd 脅迫下油菜幼苗生長的影響

由表3可見，5～20μmol/L ABA 處理不同程度地緩解了Cd對油菜幼苗生長的抑制，且緩解作用隨著濃度的增加呈現先增強后減弱的趨勢，在高濃度（30 μmol/L）時出現了加劇毒害的效果。當ABA 的濃度為15μmol/L 時，緩解作用最佳，油菜幼苗的地上部鮮重、根系鮮重、地上部干重、根系干重、SPAD值以及根系活力分別較單獨Cd 處理增加了36.41%、99.22%、44.01%、44.17%、27.60% 和92.26%（表3）。因此選擇15μmol/L 作為后續ABA的處理濃度。

表3 不同濃度的ABA預處理后對鎘脅迫下油菜幼苗生長的影響Table 3 Effects of different concentrations of ABA treatments on rapeseed growth

2.3 外源ABA對Cd脅迫下油菜根系形態的影響

由表4 可見，Cd 處理顯著抑制了油菜根系的生長發育，總根長、總根表面積、總根投影面積、總根尖數、分枝數和交叉數均顯著下降，與CK 相比分別降低57.78%、45.87%、50.51%、59.23%、29.58%和72.22%。相反，根平均直徑較對照顯著增加了17.65%。從根系形態的掃描圖片也可直觀看出20μmol/L Cd 處理后油菜幼苗根系生長嚴重受抑，與CK 相比，根系明顯瘦?。▓D1）。表明，Cd 毒害會抑制根系伸長和側根發育，同時導致根系膨大變粗。外源添加ABA處理后，Cd引起的根系伸長和側根發育受抑程度顯著減輕，總根長、總根尖數、分枝數和交叉數顯著增加，與Cd 處理相比分別增加了73.22%、157.63%、74%和106.32%（表4，圖1），表明ABA可以緩解Cd對油菜根系形態的損害。

表4 ABA預處理對鎘脅迫下油菜根系生長的影響Table 4 Effects of ABA pretreatment on root morphology of rapeseed under cadmium stress

圖1 不同處理條件下油菜根系生長情況表型Fig.1 Root phenotype of rapeseed under different treatments

2.4 外源ABA處理對油菜體內Cd含量的影響

由圖2 可見，ABA+Cd 處理可顯著降低Cd 在油菜地上部和根系中的積累。與單獨Cd處理相比，添加ABA 后油菜地上部和根系中的Cd 含量分別下降了31.17%（圖2A）和34.89%（圖2B）。Cd 轉運系數在處理間差異不顯著（圖2C）。

圖2 ABA預處理對Cd脅迫下油菜體內Cd含量的影響Fig.2 Effects of ABA on Cd concentrations in rapeseed seedlings under Cd stress

2.5 外源ABA 處理對Cd 脅迫引起的油菜氧化損傷的影響

從圖3A 可見，Cd 處理后油菜根系MDA 與對照相比顯著增加，ABA+Cd 處理可顯著降低MDA的積累，與Cd 處理相比下降了20.87%。H2O2和等活性氧的過量產生是Cd 脅迫導致氧化損傷的重要原因。Cd 處理下H2O2含量與CK 相比無顯著變化（圖3B），而O2·-含量顯著增加，約是對照的131.37%，ABA 處理顯著抑制了油菜根系中O2·-的過量積累，比單獨Cd 處理下降了38.89%（圖3C）。

圖3 ABA處理對Cd脅迫下油菜根系活性氧含量的影響Fig.3 Effects of ABA on ROS contents in Cd-stresses rapeseed seedlings

2.6 外源ABA 處理對Cd 脅迫下油菜抗氧化酶活性的影響

由圖4 可見，Cd 處理下，SOD 活性顯著下降，CAT 活性顯著增加，POD 活性無顯著變化。外源添加ABA 后，SOD、CAT 和POD 活性分別比Cd 處理下分別增加了158.05%，28.59%和34.62%（圖4），表明，Cd 處理干擾了抗氧化酶體系的運行，而ABA 可通過增強抗氧化酶的活性抑制活性氧的過量積累。

圖4 ABA預處理對Cd脅迫下油菜根系抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of ABA on the activities of antioxidant enzymes in rapeseed seedlings under Cd stress

3 討論與分析

鎘（Cd）脅迫會影響作物的生長和發育，導致作物的產量和品質下降，進而影響糧食和食品安全[3,19,24]。大量的研究表明，植物遭受Cd 毒害時首先表現為生長受抑和葉片萎黃，因而生物量和葉綠素含量常被用作評價植物遭受Cd 脅迫程度的重要指標[24～26]。本試驗結果表明，油菜在低濃度（5 μmol/L）Cd 處理下生長影響不大，隨著Cd 濃度的增加，便會顯著抑制油菜幼苗的生長，主要表現為油菜幼苗的地上部和根系干鮮重、SPAD 值、根系活力等顯著下降。這一結果與張大為等[27]的研究結果相似。脫落酸（ABA）是一種植物脅迫激素，也參與了植物對Cd脅迫的耐性響應[10,12,28～30]。例如，Cd脅迫處理能顯著提高西紅柿[14]、水稻[15]、柑橘[16]等植物內源ABA 的含量。同時，外源ABA 應用顯著緩解了水稻[19]、小麥[20]、綠豆[18]、擬南芥[10]等植物的Cd 毒害癥狀，但是ABA 最佳的處理濃度因植物種類、栽培方式以及處理時間而異。本研究結果顯示，5～20 μmol/L ABA處理不同程度緩解了Cd 對油菜幼苗生長的毒害作用，改善了葉片黃化和根系形態受抑程度，且濃度為15μmol/L時，油菜幼苗的地上部鮮重、根系鮮重、地上部干重、根系干重、SPAD 值以及根系活力等各項指標較單獨Cd處理差異最為顯著。因此，我們選擇15 μmol/L 的ABA 處理進行后續試驗，并且發現其作用可能是通過降低Cd 吸收積累和增強抗氧化酶活性，進而緩解Cd積累引起的氧化脅迫。

根系是植物最先與污染土壤接觸的器官，也是植物遭受Cd 毒害的首要部位[3,31]。研究顯示，植物根系可通過調整自身的形態來應對Cd毒脅迫，主要表現為主根伸長受抑，側根和根毛發育不良等[32,33]。本試驗結果顯示，Cd處理后油菜幼苗的根系明顯受損，總根長、總根表面積、根尖數、分枝數以及交叉數均顯著下降，而根平均直徑顯著增加（表4 和圖1）。根系生長和形態的損傷會阻礙其對水分和養分的吸收，進而導致地上部的生長受抑[32]。外源ABA 處理后，顯著緩解了Cd 對油菜幼苗根系的損傷，總根長、根尖數、分枝數和交叉數顯著增加（表4和圖1），根系活力顯著增加（表3）。在綠豆中的研究也發現，ABA處理可顯著緩解Cd對根系生長的抑制作用，增加根系生物量和不定根的數量[18]。表明，ABA 處理有利于維持Cd 脅迫下油菜幼苗根系的生長和形態，進而改善地上部的生長，增強其對Cd 的耐性。

植物遭受Cd 脅迫程度常與植物體內Cd 積累量密切相關，在生產上采取措施降低Cd在植物體內的積累或轉運則可以緩解Cd 對植物的毒害[33～36]。研究顯示，ABA對植物體內Cd的吸收和轉運具有調控作用[10,12]。例如，Fan 等[10]在擬南芥中的研究發現低濃度的ABA 應用可通過抑制二價鐵轉運體IRT1表達，減少根系對Cd 的吸收。在水稻中研究顯示，外源ABA 處理可顯著降低Cd 在水稻植株中的積累，這可能是通過降低蒸騰速率進而減弱Cd 轉運實現的[19]。我們的研究結果顯示，外源ABA 處理顯著降低了Cd在油菜幼苗地上部和根系中的積累，但對于Cd 轉運系數并沒有顯著影響（圖2），表明ABA 很有可能是通過直接抑制油菜Cd 吸收降低其在植株體內的積累。但是，在油菜中ABA 具體是通過何種途徑降低Cd吸收的尚不清楚，值得進一步探究。

鎘在植物體內積累會引發一系列生理生化過程紊亂，其中活性氧（包括H2O2、O2·-和OH-等）的過量積累被認為是Cd 毒害的重要原因[11,37～38]。研究顯示，ROS 過量積累會引起氧化脅迫，導致膜脂過氧化，細胞膜完整性破壞等，從而干擾細胞功能的正常行使[39]。本試驗結果顯示，Cd 處理后油菜幼苗根系MDA 含量較對照顯著增加，而ABA 處理后則可顯著降低由Cd 引起的MDA 含量增加（圖3A），表明ABA 可以緩解油菜幼苗根系中由于Cd 引起的膜脂過氧化損傷。進一步測定ROS的含量顯示，Cd處理下氧化損傷的產生主要是由于O2·-的大量產生引起，外源ABA 處理顯著抑制了O2·-含量的增加（圖4）。由此表明，外源ABA 處理緩解油菜幼苗Cd 毒害是由于其維持ROS穩態進而減輕氧化脅迫程度。

研究顯示，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶直接參與了逆境條件下植物體內ROS 的產生和清除過程，在植物抵御逆境脅迫中具有重要的作用[38～40]。其中，SOD主要催化氧化活性較強的O2·-歧化成無毒的O2釋放掉和毒性相對較弱的H2O2，而H2O2則進一步可在CAT 和POD 的作用下，分解為無毒的H2O 和O2，從而避免ROS 過量積累[22,39]。我們的試驗結果顯示，Cd 處理顯著抑制了油菜根系SOD 酶的活性（圖4A），這可能是O2·-過量積累的重要原因。而Cd 脅迫條件下H2O2沒有顯著積累的原因則可能是因為CAT 活性的增加（圖4B）。外源ABA 處理顯著提高了SOD 的活性，促進了O2·-歧化分解，與此同時，同步增加了CAT 和POD 活性，增強H2O2清除能力，避免了H2O2過量積累（圖3 和4）。由此表明，外源ABA 應用可通過增強抗氧化酶系統中SOD、CAT 和POD 的活性提高油菜體內ROS 清除能力，緩解由ROS過量積累導致的氧化脅迫。

4 結論

綜上所述，外源ABA 處理可顯著緩解Cd 對油菜幼苗生長和根系形態的毒害作用，其主要機制是通過抑制Cd吸收和增強抗氧化酶活性，進而減少由Cd 積累引發的ROS 過量積累，減輕Cd 引起的氧化損傷和對植株的毒害作用。但是關于ABA 是如何影響Cd吸收的尚不清楚。此外，ABA是否與其他參與植物Cd 脅迫響應的植物激素或信號分子協同作用調控植物Cd 脅迫耐性？這些問題都有待進一步探討，從而為用于Cd污染土壤安全利用的作物品種培育和栽培調控技術研發提供理論依據。