外源褪黑素對菜用大豆殘留百菌清和多菌靈降解的影響

陳秋森，陳鳳瓊，劉漢林，褚霈宇，王華美，任春元，趙強，曹亮，于高波，張玉先

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶,163319）

菜用大豆又稱毛豆，是豆科大豆屬的栽培大豆種，屬于特用大豆[1,2]。作為世界上最大的菜用大豆生產國和出口國，中國的菜用大豆栽培面積不斷增加，其病蟲害也頻繁發生，嚴重影響了我國菜用大豆的產量和品質[3,4]。目前防治病蟲害的有效方式仍以施用農藥為主。然而，由于菜用大豆是采收鮮莢，直接剝粒食用，農藥的不當使用會給人們的身體健康帶來巨大的隱患，同時對生態環境也有不利影響[5]，各國對菜用大豆農藥殘留也都有嚴格要求[6]。因此，減少菜用大豆的農藥殘留已成為保障菜用大豆產品質量和食用安全的基本要求，同時也是提高菜用大豆出口合格率的重要措施。

多菌靈和百菌清是常見的殺菌劑，可有效防治菜用大豆灰斑病、莢枯病、根腐病等真菌性病害的發生，廣泛應用于菜用大豆的生產[7]，然而過量或不合理使用多菌靈和百菌清極易造成菜用大豆的農藥殘留問題。因此，降低菜用大豆中多菌靈和百菌清殘留在大豆生產中具有重要的科學和現實意義。

褪黑素是一種廣泛存在于動植物體內的多效性分子[8]，在干旱、低溫、鹽堿等非生物脅迫中均具有積極的調控作用[9]。近年來，相關研究發現，褪黑素在降解植物農藥殘留中也具有重要作用。陳媛媛等[10]研究發現褪黑素能夠緩解甜瓜幼苗三唑酮毒害的生理效應。而Wei 等[11]研究也表明，褪黑素處理還可以提高蘋果對百草枯的耐受性。此外，近年來表達褪黑素合成相關基因被認為可提高植物抗逆性，在擬南芥、水稻、番茄等植物中均已得到驗證[12～14]。但是關于褪黑素對菜用大豆殘留殺菌劑的降解是否具有調控效應鮮有報道。因此，本研究以菜用大豆為材料，以多菌靈和百菌清為殺菌劑，探究外源褪黑素處理對菜用大豆殘留殺菌劑降解的調控效應，以期為后續大豆農藥殘留降解的研究和促進殘留農藥代謝試劑的開發應用提供必要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜用大豆品種浙鮮12，由國家雜糧工程技術研究中心提供；褪黑素（C13H16N2O2），購自Sigma Aldrich公司。

1.2 試驗處理

試驗于黑龍江八一農墾大學生物技術中心人工氣候室進行，盆栽，基質為草炭土和蛭石（3∶1），播種前選取色澤均勻、顆粒飽滿、大小一致的種子，用5%的次氯酸鈉消毒，于2020 年5 月6 日進行播種，播種后常規管理。待菜用大豆生長至R3 期（初莢期，2020年7月3日）進行處理與取樣。

將植株隨機分為4組：①百菌清處理：使用蒸餾水連續噴施3 d，第4 d噴施有效濃度為11.2 mmol/L的百菌清；②百菌清+褪黑素處理：100μmol/L 褪黑素進行葉面噴施，連續處理3 d，第4 d噴施有效濃度為11.2 mmol/L 的百菌清；③多菌靈處理：使用蒸餾水連續噴施3 d，第4 d噴施有效濃度為13.1 mmol/L的多菌靈；④多菌靈+褪黑素處理：100μmol/L 的褪黑素進行葉面噴施，連續處理3 d，第4 d噴施有效濃度為13.1 mmol/L 的多菌靈溶液。于殺菌劑處理24 h 后取樣，部分保存于-20℃，用于生理生化指標的測定，部分保存于-80℃，用于基因表達量的測定。農藥處理7 d 后取樣，-20℃保存用于測定農藥殘留量。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 農藥殘留量 參照任曉萍等[15]的方法測定菜用大豆葉片中百菌清殘留量，參照郝露露等[16]的方法測定菜用大豆葉片中多菌靈殘留量。

1.3.2 氧化損傷指標 采用硫代巴比妥酸法[17]測定菜用大豆葉片中丙二醛（MDA）含量，參考劉俊等[18]的方法測定菜用大豆葉片中過氧化氫（H2O2）含量。

1.3.3 抗氧化系統 采用比色法[19]測定菜用大豆葉片中的抗壞血酸（AsA）含量，參考Ma 等[20]的方法測定菜用大豆葉片中的還原型谷胱甘肽（GSH）含量，采用氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性[21]。1.3.4 解毒系統 參考Sharma 等[22]的方法測定菜用大豆葉片中的非蛋白結合態巰基（NPT）含量，采用試劑盒方法測定（購自睿信生物科技有限公司）ABC 轉運蛋白活性。采用實時熒光定量PCR 測定菜用大豆葉片中解毒相關基因（P450、GST22和ABC-C3）表達量[23]。

1.4 數據處理

所得數據用Microsoft Excel 2010 進行數據分析，并采用利用SPSS 21.0 軟件對各處理間顯著性進行分析，最終利用Origin 2019軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 外源褪黑素處理對菜用大豆體內農藥殘留量的影響

如圖1A 所示，經褪黑素預處理后，菜用大豆葉片中多菌靈和百菌清殘留量均顯著降低。其中百菌清殘留量為單獨農藥處理的56%，多菌靈殘留量為單獨農藥處理的84%。非蛋白結合態巰基（NPT）主要包括谷胱甘肽及其共軛物和代謝產物。如圖1B 所示，與單獨多菌靈和百菌清處理相比，外源褪黑素預處理后菜用大豆葉片中NPT 含量均顯著上升，說明外源褪黑素處理有效地促進菜用大豆中NPT的形成，增強多菌靈和百菌清的降解代謝，減少菜用大豆體內的農藥殘留含量。

圖1 外源褪黑素處理后菜用大豆葉片中農藥殘留量（A）和NPT含量（B）Fig.1 Pesticide residue（A）and NPT content（B）under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves

2.2 外源褪黑素處理對菜用大豆體內GSH-AsA途徑的影響

外源褪黑素處理影響菜用大豆葉片中GSH 和AsA的含量（圖2）。在多菌靈和百菌清處理下，外源褪黑素預處理可顯著提高菜用大豆中GSH（圖2A）和AsA（圖2B）含量。其中，與單獨百菌清處理相比，褪黑素預處理后菜用大豆中GSH和AsA含量分別上升24.1%和72.5%；與單獨多菌靈處理相比，褪黑素預處理后菜用大豆中GSH和AsA含量分別上升40.5%和34.7%。由此可見，外源褪黑素處理可以通過提高GSH和AsA含量促進GSH-AsA循環，進而促進菜用大豆中殘留多菌靈和百菌清的降解。

圖2 外源褪黑素處理后菜用大豆葉片中GSH（A）和AsA含量（B）Fig.2 GSH（A）and AsA content（B）under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves

2.3 外源褪黑素處理對菜用大豆體內抗氧化酶活性的影響

外源褪黑素預處理可顯著提高菜用大豆葉片中抗氧化酶活性（圖3）。與單獨百菌清處理相比，褪黑素預處理后菜用大豆葉片中SOD 活性（圖3A）和CAT 活性（圖3C）均顯著上升，且分別上升14.5%和25.4%，而菜用大豆中POD 活性卻有所下降（圖3B），APX活性則無顯著性差異（圖3D）；與單獨多菌靈處理相比，預處理褪黑素后菜用大豆中SOD、POD、CAT 和APX 活性均顯著上升，其中SOD 活性提高最為顯著，比單獨多菌靈處理提高了4.5倍（圖3A），其次為POD 活性，比單獨多菌靈處理提高了102.2%（圖3B），而CAT 活性和APX 活性則分別提高了92.3%和38.7%（圖3C、D）。由此可見，外源噴施褪黑素可顯著增強菜用大豆中抗氧化酶活性，促進活性氧的清除，進而緩解農藥處理造成的細胞損傷，降低菜用大豆體內的農藥殘留。

圖3 外源褪黑素處理下菜用大豆葉片中抗氧化酶活性Fig.3 Antioxidant enzyme activitiesunder exogenous melatonin treatment onvegetable soybean leaves

2.4 外源褪黑素處理對菜用大豆體內MDA 和H2O2含量的影響

外源褪黑素預處理對菜用大豆葉片中MDA 和H2O2含量的影響如圖4所示。在多菌靈和百菌清處理下，通過外源褪黑素預處理可顯著降低菜用大豆中MDA 含量（圖4A）。與單獨百菌清和多菌靈處理相比，預處理褪黑素可使菜用大豆中MDA含量分別降低了8.5%和8.9%?？梢娡庠赐屎谒靥幚砜梢酝ㄟ^降低菜用大豆中MDA含量，從而抑制細胞膜脂過氧化程度的增加，緩解農藥脅迫下菜用大豆細胞受到的損傷。此外，外源褪黑素預處理后，大豆體內H2O2含量也顯著性降低（圖4B），與單獨百菌清處理相比，外源褪黑素預處理使菜用大豆體內H2O2含量降低13.6%，與單獨多菌靈處理相比，預處理褪黑素使菜用大豆體內H2O2含量降低8.0%。這說明外源褪黑素處理可通過直接清除菜用大豆體內活性氧來緩解農藥對植株造成的氧化損傷，進而促進大豆體內殘留農藥的降解代謝。

圖4 外源褪黑素處理后菜用大豆葉片中MDA（A）和H2O2（B）含量Fig.4 MDA（A）and H2O2（B）contents under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves

2.5 外源褪黑素處理對菜用大豆體內解毒系統的影響

細胞色素P450、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）和ABC 轉運蛋白是植物體內重要的解毒酶，可以有效緩解農藥處理對植物造成的損傷。外源褪黑素預處理影響菜用大豆體內解毒系統（圖5）。經外源褪黑素預處理后，菜用大豆葉片中解毒基因表達量顯著上升。與單獨百菌清處理相比，預處理褪黑素后菜用大豆葉片中P450和GST22的相關基因表達量顯著上調，其中P450相關基因表達量為單獨百菌清處理的14.5倍（圖5A），GST22相關基因表達量為單獨百菌清處理的1.3 倍（圖5B）。而ABC-C3相關基因表達量經褪黑素預處理后反而低于單獨百菌清處理（圖5C），為此我們測定了菜用大豆葉片中ABC轉運蛋白活性進行驗證（圖5D），其結果與相關基因表達量變化趨勢一致。與單獨多菌靈處理相比，外源褪黑素預處理后菜用大豆葉片中P450、GST22和ABC-C3相關基因表達量均顯著上調，且分別比單獨多菌靈處理上調了182.2%、141.9%和413.4%（圖5A、B、C），此外，經褪黑素預處理后ABC 轉運蛋白活性也比單獨多菌靈處理提高了36.2%（圖5D）。由此可見，外源褪黑素處理可調控菜用大豆中解毒基因的表達，進而提高解毒酶活性，促進菜用大豆體內多菌靈和百菌清的代謝，從而降解菜用大豆中的農藥殘留。

圖5 外源褪黑素處理后菜用大豆解毒系統相關基因的表達量Fig.5 Expression of genes related to detoxification system of vegetable soybean treated with exogenous melatonin

3 討論

對于植物來說，農藥是一種異源物質，高劑量的農藥導致植物體內活性氧（ROS）的過量產生，這些活性氧具有高度的活性和毒性，最終導致氧化應激，對細胞產生毒性作用[24]。Kanwar等[25]研究發現，外源褪黑素處理使番茄中的活性氧含量顯著降低，提高了作物對雙酚A 的解毒作用。在本研究中，預處理外源褪黑素降低了殺菌劑處理下菜用大豆中H2O2的含量，從而緩解了殺菌劑對菜用大豆造成的細胞毒性?？梢娡庠赐屎谒靥幚砜赏ㄟ^直接清除菜用大豆體內的活性氧，從而有效緩解農藥處理對菜用大豆造成的氧化損傷，提高菜用大豆對農藥的耐受性。同時，在外源褪黑素處理下，菜用大豆中MDA 含量也顯著降低，說明外源褪黑素可有效抑制菜用大豆的膜脂過氧化，降低農藥處理對菜用大豆造成的細胞損傷。

植物細胞及其細胞器如葉綠體、線粒體和過氧化物酶體等通過抗氧化防御系統保護自身免受活性氧的傷害。植物的抗氧化防御系統包括非酶抗氧化劑和抗氧化酶[26]。AsA-GSH 循環是非酶抗氧化劑防御的主要途徑，它們不僅可以直接清除一定范圍的ROS，而且在細胞質和其他細胞器中維持氧化還原狀態，從而增強抗氧化能力，并減少由不同的非生物脅迫引起的氧化應激[27]。Fatma 等[28]研究發現，芥菜中AsA、GSH 含量提高可通過清除活性氧緩解鹽脅迫帶來的傷害；Xia 等[29]研究發現，外源褪黑素處理可以誘導干旱脅迫下獼猴桃中的AsAGSH 循環。在本研究中，多菌靈和百菌清處理下，外源褪黑素處理可以顯著提高菜用大豆中GSH 和AsA 含量，說明外源褪黑素處理可以通過調節AsA-GSH 循環清除菜用大豆體內活性氧，從而減少菜用大豆在農藥處理下受到的傷害，降低農藥殘留量。

逆境脅迫下，植物體內的抗氧化酶活性顯著增強，SOD、POD、CAT 和APX 是植物酶促防御系統的四種重要抗氧化酶，能有效分解活性氧自由基，從而減少植物在逆境脅迫中受到的傷害[30]。Li 等[31]研究表明，外源褪黑素處理可以提高鹽脅迫下西瓜體內的抗氧化酶活性；張明聰等[32]研究發現，外源褪黑素處理可以提高干旱脅迫下大豆體內的抗氧化酶活性。在本研究中，外源褪黑素處理顯著提高了多菌靈處理下菜用大豆中4 種抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）的活性，并且顯著提高了百菌清處理下菜用大豆中SOD 和CAT 的活性，從而促進了活性氧的清除，緩解了菜用大豆在多菌靈和百菌清處理中受到的傷害，促進了殘留百菌清和多菌靈的降解。

褪黑素作為一種多效性分子，在植物體內廣泛存在，可有效緩解植物面臨的多種非生物脅迫[33]。近年來，褪黑素在降解植物農藥殘留中的作用引起了科研人員的廣泛研究。Ding 等[34]研究發現，外源褪黑素處理可以有效提高楊樹對甲基紫精的耐受性，而Liu 等[35]研究也發現，外源褪黑素處理可有效降低黃瓜中吡蟲啉的殘留量。此外，前人研究發現，當植物遭受農藥脅迫時，激活自身解毒機制以緩解脅迫帶來的損傷[36]。植物的解毒過程可分為三個階段。第一階段是由細胞色素P450 催化的酶促反應及非酶過程；第二階段主要是谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）與糖基轉移酶等的軛合反應；在第三階段，代謝產物在ABC 轉運蛋白的調控下被進一步轉運到細胞質外[37,38]。Yuan 等[39]研究發現細胞色素P450 是生物體內的重要代謝酶，能夠降解大多數外源有毒物質；而李冬琴等[40]研究證明，水稻中GST活性提高有利于緩解鎘脅迫帶來的傷害；此外，也有研究發現，ABC 轉運蛋白可以提高植物對草甘膦的抗性[41]。本試驗中，在百菌清處理下，外源褪黑素預處理可以顯著提高菜用大豆中P450、GST的相關基因表達量，但菜用大豆中ABC 轉運蛋白相關基因表達量經褪黑素預處理后反而有所降低，因此，我們對ABC 轉運蛋白酶活性進行了驗證，結果與ABC 相關基因表達量趨勢一致。而在多菌靈處理下，經外源褪黑素預處理后菜用大豆中P450、GST、ABC的相關基因表達量均顯著提高。這說明百菌清處理下，外源褪黑素處理可以通過誘導一相和二相解毒相關基因的表達以促進菜用大豆中殘留百菌清的降解；而在多菌靈處理下，外源褪黑素處理則可以通過誘導菜用大豆解毒過程三個階段的相關基因表達以促進其殘留多菌靈的降解。本研究還發現，通過外源褪黑素處理，菜用大豆中NPT 含量顯著上升，促進了菜用大豆體內殺菌劑的降解，有效降低了菜用大豆中多菌靈和百菌清的殘留量。這一結果與Liu 等研究發現的外源褪黑素可有效降低黃瓜中吡蟲啉殘留量的結果一致。

4 結論

外源褪黑素處理可以直接清除菜用大豆體內的活性氧，緩解殺菌劑處理對菜用大豆的細胞損傷，也可以通過提高菜用大豆中GSH-AsA含量和抗氧化酶活性，從而促進活性氧的清除，增強菜用大豆中殘留百菌清和多菌靈的代謝。與此同時，在多菌靈和百菌清處理下，外源褪黑素預處理還可以通過誘導解毒相關基因的表達，提高解毒酶活性，促進菜用大豆中殘留多菌靈和百菌清的降解代謝。綜上所述，外源褪黑素處理可以有效緩解殺菌劑處理對菜用大豆受到的細胞損傷，促進菜用大豆對殘留殺菌劑的解毒作用，從而降低菜用大豆中多菌靈和百菌清的殘留量。