基于染料標記的核酸適配體對氯霉素的比率定量檢測

熊威威，汪 鵬，李文恒，向東山?，翟 琨?

1. 湖北民族大學生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北恩施445000；2. 湖北民族大學化學與環境工程學院，湖北恩施445000

0 引 言

氯霉素(chloramphenicol, CAP)是一種應用廣泛的廣譜抗生素，對大多數霉菌感染都有良好的抑制作用[1，2]。研究表明，人體吸收過量的CAP 會導致再生障礙性貧血、白血病和灰嬰綜合征等疾病[3]。CAP 在許多國家已被禁止使用，在我國也被禁止用于畜牧和水產養殖[4]。然而，由于CAP 的低成本和廣譜性，現在仍然被廣泛使用[5]。因此，建立一種快速、靈敏及簡便的定量檢測CAP 的新方法具有十分重要的意義。目前，CAP 的定量分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6]、氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用法[7]、液相色譜-質譜聯用法[8]、拉曼散射法[9]和基于抗體技術分析法[10]等。然而，在這些分析方法中，拉曼散射法和基于抗體技術分析法檢測過程復雜、耗時長，GC-MS 法及液相色譜-質譜聯用法需要昂貴的儀器和專業的操作人員，高效液相色譜法在復雜樣品中分離效果不理想，檢測特異性相對較差，不適合對CAP 進行快速而準確的檢測。

核酸適配體(aptamer)是通過體外篩選技術得到的一段可與目標物特異性結合的寡核酸片段[11～15]。隨著核酸適配體技術的發展與應用，很多物質的適配體被篩選出來[16，17]。CAP 特異性適配體于2011年被Mehta 等人[18]篩選出來，并成功地應用于CAP的檢測中[19，20]。與已有的CAP 檢測方法相比，基于核酸適配體的CAP 檢測方法具有選擇性好、準確度高、操作簡單及檢測成本低等優點。

SYBR Green Ⅰ(SG-Ⅰ)是一種可與雙鏈DNA無選擇性結合的核酸染料[21]，毒性低、穩定性好，在水溶液中背景信號較低，與單鏈DNA 幾乎不發生作用，而與雙鏈DNA 作用后產生強熒光信號，常用于無標記熒光分析檢測中[22]。

基于上述工作，本文利用熒光染料ROX 標記的CAP 核酸適配體及核酸染料SG-Ⅰ構建了一種比率型熒光探針，并利用該熒光探針實現了對CAP 高選擇性的定量檢測。與利用單一熒光信號建立的檢測方法相比，本方法具有兩個主要的優勢：第一，利用高靈敏的核酸染料SG-Ⅰ產生熒光信號，可顯著提高方法的靈敏度，降低檢出限，適合低濃度CAP 的定量檢測；第二，利用兩種熒光信號的比值實現CAP 的定量檢測，可顯著減少環境因素對檢測結果的干擾，從而提高檢測結果的重復性和準確度。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所有的熒光數據和熒光光譜均由RF-5301PC型熒光光譜儀(Shimadzu 公司)測定和采集；緩沖溶液的pH 值由PHS-3C 型pH 計(INESA 公司)測定。核酸染料SG-Ⅰ（用二甲基亞砜DMSO 配制的10 000倍濃縮液）由上海瑞安生物技術有限公司提供；氧化石墨烯（GO）購于中科院成都有機化學研究所。

實驗中所用化學試劑均為分析純，購自中國國藥化學試劑有限公司；CAP 核酸適配體PLV 與有機猝滅基團標記且與CAP 核酸適配體部分互補的單鏈DNA（PC）均由上海生工生物技術有限公司合成并用高效液相色譜法純化，PLV 的3′端標記熒光染 料6-carboxy-x-rhodamine（ROX），PC 的5′端 標記猝滅基團Black Hole Quencher 2（BHQ-2）。其核酸的堿基序列如下：

1.2 樣品的制備及檢測

基于比率型熒光探針檢測CAP 的樣品配制中，用0.1 mol/L 的Tris-HCl(pH 7.7)緩沖溶液將CAP配制成不同濃度的溶液，并放置于4 °C 下冷藏備用；用0.1 mol/L 的Tris-HCl 緩沖溶液分別將PLV和PC配制成1×10-7mol/L 和1.2×10-7mol/L 的溶液備用；用Tris-HCl 緩沖溶液將核酸染料SG-Ⅰ稀釋10 000 倍得到SG-Ⅰ工作液，放置于4 °C 下儲存備用。樣品制備時，分別取50 μL 配制好的CAP和PLV溶液于離心管中，然后加入50 μL 的PC 溶液與50 μL 的SG-Ⅰ工作液，并補充緩沖溶液至總體積為500 μL，在溫度為37 °C 的水浴鍋中反應30 min，冷卻到常溫后對其進行同步熒光分析。在進行同步熒光分析時，初始激發波長設置為454 nm，同步掃描的波長間隔(Δλ)設置為26 nm，熒光檢測范圍為480～700 nm，激發光狹縫的寬度設置為10 nm，發射光狹縫的寬度設置為5 nm。SG-Ⅰ和ROX 的最大發射波長分別為525 nm 和613 nm，在進行定量分析時所使用的數據為SG-Ⅰ和ROX 的最大發射波長處的熒光強度。

基于GO 猝滅的單色熒光樣品的配制中，用0.1 mol/L 的Tris-HCl 緩沖溶液(pH 7.7)將PLV 配制成1.4×10-7mol/L 濃度。樣品制備時，分別取50 μL配制好的PLV 溶液和10μL濃度為0.5 mg/mL 的GO 溶液于離心管中，在室溫下孵育10 min，然后加入50 μL 的CAP 溶液，補充Tris-HCl 緩沖溶液至總體積為500 μL，在37 °C 的水浴鍋中反應30 min 后，冷卻到常溫后對其進行同步熒光分析。在進行同步熒光分析時，初始激發波長設置為536 nm，同步掃描的Δλ設置為28 nm，熒光檢測范圍為564～670 nm，激發光狹縫的寬度設置為10 nm，發射光狹縫的寬度設置為5 nm。在進行定量分析時所使用的數據為ROX 最大發射波長處的熒光強度。

1.3 實際樣品的處理與檢測

主要對CAP 純牛奶和滴眼液中CAP 的含量進行測定。1）對于純牛奶中CAP 的檢測。取5 mL純牛奶置于10 mL 離心管中，加入5 mL 乙酸乙酯后進行振蕩，然后離心10 min (4 000 r/min)，取上清液，再加入5 mL 乙酸乙酯重復上述操作兩次。將收集的上清液用氮氣吹干，然后用0.01 mol/L 的Tris-HCl(含10%甲醇)定容至100 mL，再用本方法進行檢測。2）對于CAP 滴眼液中CAP 的檢測。根據其說明書中標注的濃度，在本實驗可檢測濃度范圍內，用Tris-HCl 緩沖溶液將樣品稀釋成3 組不同濃度的溶液，然后分別用本方法進行檢測，計算檢測結果的平均值并與說明書中標注的濃度進行比較。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

利用PLV、PC 及SG-Ⅰ檢測CAP 的基本原理如圖1 所示。其中，CAP 核酸適配體的3′端標記了熒光染料ROX，與CAP 核酸適配體部分互補的單鏈DNA 的5′端修飾了猝滅基團BHQ-2。當體系中不存在CAP 時，PLV 與PC 通過堿基互補配對形成雙鏈DNA，熒光染料ROX 與猝滅基團BHQ-2 相互靠 近，ROX 的熒光被BHQ-2 猝滅，ROX的熒光信號很弱，但形成的雙鏈DNA 與核酸染料SG-Ⅰ結合，使SG-Ⅰ的熒光強度顯著增強，此時IROX/ISG-Ⅰ較小。當體系中存在CAP 時，由于CAP 與PLV 的親和力更強，CAP 優先與PLV 結合形成穩定性更好的復合物，此時PLV 不能與PC 反應形成雙鏈DNA，熒光染料ROX 無法靠近猝滅基團BHQ-2，熒光不能被BHQ-2 猝滅，ROX 熒光信號很強。另外，由于體系中沒有雙鏈DNA，SG-Ⅰ只能游離于溶液中，其熒光信號很弱，此時IROX/ISG-Ⅰ較大。體系中CAP 的濃度越大，與PLV 結合形成的復合物就越多，ROX 的熒光信號就越強，SG-Ⅰ的熒光信號就越弱，IROX/ISG-Ⅰ就越大。根據體系中加入CAP 后IROX/ISG-Ⅰ的變化即可實現對CAP 定量分析。

圖1 基于比率型熒光探針檢測CAP 的原理Fig.1 The principle of detection for CAP based on ratiometric fluorescent probe

利用PLV 和GO 對CAP 定量檢測的基本原理如圖2 所示。當體系中存在目標物CAP 時，CAP 與PLV 結合形成穩定的復合物，PLV 的空間結構發生變化，導致ROX 遠離GO，ROX 與GO 之間的熒光共振能量轉移效應消失，ROX 的熒光得到恢復，體系熒光信號很強；當體系中不存在目標物CAP 時，PLV 中的單鏈DNA 與GO 通過強烈的π-π 堆疊作用使PLV 吸附在GO 的表面[23]，標記在PLV 上的熒光染料ROX 靠近GO，其熒光通過熒光共振能量轉移的方式被GO 猝滅，體系熒光信號很弱。據此，通過體系熒光強度恢復的程度即可實現CAP 的定量分析。

圖2 基于核酸適配體與GO 檢測CAP 的原理Fig.2 The principle of detection for CAP with aptamer and GO

2.2 方法的可行性分析

圖3 為基于比率型熒光探針檢測CAP 分析法中，PLV 與不同濃度的CAP 反應后，體系中核酸染料SG-Ⅰ和熒光染料ROX 的同步熒光光譜圖。結果表明，當體系中不存在CAP 時，熒光染料ROX 的熒光信號很弱而核酸染料SG-Ⅰ的熒光信號很強；當體系中存在CAP 時，熒光染料ROX 的熒光信號顯著增強而SG-Ⅰ的熒光信號明顯減弱。體系中CAP 的濃度越大，熒光染料ROX 熒光信號就越強，SG-Ⅰ的熒光信號就越弱，這說明利用該方法對CAP 進行定量檢測是可行的。

圖3 不同濃度的CAP 所對應體系的同步熒光光譜Fig.3 The synchronous fluorescence spectra of system at different concentrations of CAP

2.3 實驗條件的優化

核酸染料SG-Ⅰ工作液的加入量對檢測結果具有很大影響。根據檢測CAP 的原理，SG-Ⅰ工作液應該保持相對過量，但過量太大又會產生一定的背景熒光，因此本實驗對SG-Ⅰ工作液的體積進行了優化。如圖4 所示，當SG-Ⅰ工作液的體積小于50 μL 時，SG-Ⅰ的熒光強度隨體積的增加而增強；當SG-Ⅰ工作液的體積達到50 μL 后，再增加SG-Ⅰ工作液的體積，其熒光強度幾乎不再變化。這說明在PLV 的濃度為1×10-8mol/L，PC 的濃度為1.2×10-8mol/L 時，SG-Ⅰ工作液的體積達到50 μL 時即可滿足本實驗的需求。本實驗所有樣品中SG-Ⅰ工作液的體積均選擇為50 μL。

圖4 SG-Ⅰ工作液體積的影響Fig.4 Effect of working solution volume of SG-Ⅰ

PLV 與CAP 的反應時間直接影響著PLV 與CAP 配位反應的程度，因此本實驗考察了PLV 與CAP 配位反應的時間。如圖5 所示，當反應時間在10～30 min 之間時，IROX/ISG-Ⅰ隨著反應時間的增加逐漸增大；當反應時間超過30 min 后，IROX/ISG-Ⅰ基本保持不變。這表明在30 min 之內，PLV 與CAP 配位反應已基本完成。因此本實驗所有樣品中PLV與CAP 的反應時間均選擇為30 min。

圖5 反應時間對IROX/ISG-Ⅰ的影響Fig.5 Effect of reaction time on IROX/ISG-Ⅰ

緩沖體系的pH 值會直接影響熒光染料ROX和核酸染料SG-Ⅰ的熒光強度，同時也會影響PLV與CAP 的配位反應，因此本實驗考察了緩沖溶液的pH 值。如圖6 所示，當緩沖體系的pH 值在6.8～7.7 之間時，IROX/ISG-Ⅰ隨 著pH 值的增加逐漸增大；當pH 值大于7.7 時，IROX/ISG-Ⅰ隨著pH 值的增加逐漸減弱。因此，本實驗中緩沖溶液的pH 值為7.7 時效果最好。

圖6 pH 值對IROX/ISG-Ⅰ的影響Fig.6 Effect of pH value on IROX/ISG-Ⅰ

反應體系中溶液的離子強度會影響PLV 與CAP 形成配合物的穩定性，因此本實驗通過加入不同濃度的NaNO3溶液，考察了溶液離子強度對檢測結果的影響。如圖7 所示，當NaNO3濃度低于60mmol/L 時，IROX/ISG-Ⅰ隨著NaNO3濃度的增大而 增大；當NaNO3濃度大于60 mmol/L 時，IROX/ISG-Ⅰ趨于穩定。因此，本實驗選擇NaNO3溶液的濃度為60 mmol/L。

圖7 NaNO3濃度對IROX/ISG-Ⅰ的影響Fig.7 Effect of NaNO3 concentration on IROX/ISG-Ⅰ

2.4 工作曲線及檢出限

在優化條件下，考察了IROX/ISG-Ⅰ與CAP 濃度之間的關系。圖8（a）為不同濃度CAP 所對應體系中ROX 及SG-Ⅰ的同步熒光光譜圖，圖8（b）為ROX與SG-Ⅰ在最大發射波長處熒光強度的比值（IROX/ISG-Ⅰ）與CAP 濃度c（mol/L）之間擬合的回歸曲線圖。結果表明，在CAP 濃 度 為2×10-10～100×10-10mol/L 范圍內，IROX/ISG-Ⅰ隨CAP 濃度的增大而增大，擬合的回歸方程為IROX/ISG-Ⅰ=0.072e0.055c(相關系數R=0.993)。將空白樣品平行測定11 次，分別計算ROX 和SG-Ⅰ熒光強度的標準偏差，再將它們標準偏差比值的3 倍代入上述回歸方程，計算得到方法的檢出限為8×10-11mol/L。對9 個濃度均為1×10-9mol/L 的平行樣品進行測定，其相對標準偏差(RSD)為1.05%，說明該方法具有良好的精密度。

圖8 (a)不同濃度CAP 所對應體系中ROX 與SG-Ⅰ的同步熒光光譜圖；(b)IROX/ISG-Ⅰ與CAP 濃度之間擬合的回歸曲線Fig.8 (a)The synchronous fluorescence spectra of ROX and SG-Ⅰin the system with different concentrations of CAP;(b)the fitting regression curve between IROX/ISG-Ⅰand the concentration of CAP

2.5 與單色熒光定量檢測的比較

利用PLV 和GO 建立單色熒光定量檢測CAP的方法，并與比率型熒光探針進行比較。首先對單色熒光定量檢測CAP 方法的條件進行優化，得到了最佳檢測條件為：GO 的濃度為10 μg/mL，PLV 與CAP 的反應時間為30 min，緩沖溶液的pH 值為7.7，緩沖溶液中NaNO3的濃度為60 mmol/L。然后，在優化的條件下，考察了ROX 熒光強度的變化值ΔI(ΔI=I-I0，I為CAP 存在時ROX 的熒光強度，I0為CAP 不存在時ROX 的熒光強度)與CAP 濃度之間的關系。圖9(a)為不同濃度CAP 所對應體系中ROX 的同步熒光光譜圖，圖9(b)為ROX 最大發射波長處的熒光強度與CAP 濃度之間的線性關系。結果表明，CAP濃度在2.8×10-10～140×10-10mol/L 范圍內，ROX 熒光強度的變化值與CAP 濃度之間具有良好的線性關系，擬合工作曲線的回歸方程為ΔI=6.776c+0.574 (R2=0.998)。將空白樣品平行測定11 次，計算標準偏差，用3 倍的標準偏差除以工作曲線的斜率得方法檢出限為1.6×10-10mol/L；對9 個濃度均為1×10-9mol/L的平行樣品進行測定，其相對標準偏差(RSD)為5.52%，說明該方法也具有較好的精密度，但與比率熒光分析法較差。

圖9 (a)不同濃度CAP 所對應體系中ROX 的同步熒光光譜；(b)ROX 的熒光強度與CAP 濃度之間的線性關系Fig.9 (a)The synchronous fluorescence spectra of ROX in the system with different concentrations of CAP;(b)the linear relationship between the fluorescence intensity of ROX and the concentration of CAP

2.6 加標回收實驗

進一步地比較兩種方法的準確性。分別用兩種方法對加入牛奶樣品中CAP 標準品的含量進行檢測。取4 份相同的純牛奶樣品，按1.3 節中的步驟對純牛奶處理后，按表1 所示加入不同濃度的CAP 標準品溶液，然后分別用單色熒光分析法（A1～A4）及比率熒光分析法(B1～B4)進行檢測，計算回收率。結果（表1）表明，比率熒光分析法的RSD 更小，回收率更接近100%，這說明在復雜的檢測環境中，比率熒光分析法對CAP 的檢測重復性更好，準確度更高。

表1 采用兩種檢測方法測定牛奶中CAP 的含量(n=3)Table 1 Determination of CAP in milk using two assay methods (n=3)

2.7 特異性分析

為了考察方法的特異性，本實驗選擇與CAP 性質相近的幾種抗生素:卡那霉素(kanamycin)、甲砜霉素(thiamphenicol)、土 霉 素(oxytetracycline)、四 環 素(tetracycline)、鏈霉素(streptomycin),進行對比實驗。分別配制1×10-6mol/L 的各種抗生素溶液，在最優條件下使用比率熒光分析CAP 的方法進行檢測。如圖10 所示，在其他抗生素濃度遠高于CAP 濃度（1×10-8mol/L）的情況下，體系中ROX 的熒光信號很弱，而SG-Ⅰ的熒光信號很強，說明該檢測方法具有很高的特異性。

圖10 方法的特異性分析Fig.10 The specificity analysis of the method

2.8 實際樣品分析

為了驗證方法的實用性，本實驗對CAP 滴眼液中的CAP 含量進行了測定。結果表明，滴眼液中CAP 的含量為2.486 mg/mL，與說明書中標注的CAP 含量2.500 mg/mL 基本一致，說明該方法對實際樣品的檢測具有較高的準確度。

3 結 語

本實驗基于PLV、PC 及核酸染料SG-Ⅰ構建了一種比率型熒光探針，并利用該探針建立了一種CAP 的定量檢測新方法。與單色熒光定量檢測CAP 的方法相比，該方法重復性更好、檢出限更低、準確度更高。同時，該方法操作簡單、檢測時間短，能用于實際樣品中CAP 的分析與檢測。