飽和硫酸銨純化重組日本囊對蝦鐵蛋白

馬貴紅，賴龍昕，李蝶，馮穎琳，李筱，張志清，李樹紅，王彩霞，顧毅，馬翼，李美良*

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)2(綿陽鐘溝生態農業科技有限公司，四川 綿陽，621000)3(四川潤兆漁業有限公司，四川 雅安，625000)

鐵蛋白是一種在生物體內廣泛存在的水溶性貯鐵和解毒蛋白[1]，由蛋白質外殼和鐵核兩部分組成。鐵核的主要成分是非均勻性磷酸鹽和鐵的復合物[2]，其最高可貯存4 500個鐵原子[3]。蛋白外殼是由24個亞基組成的呈4-3-2對稱的八面體結構[4]，內外直徑分別為8和12 nm[5]。蛋白外殼上存在的8條3倍和6條4倍(孔徑約為0.3～0.5 nm)通道，主要是用于鐵內核與外部環境的物質交換[6]。鐵蛋白的主要功能是維持生物體內的鐵代謝平衡[7-8]及通過清除鐵介導的自由基來抑制Fenton反應，從而保護細胞免受因各種環境脅迫而導致的細胞氧化性損傷[9-10]。不含礦化鐵核的鐵蛋白稱為脫鐵鐵蛋白[11]。脫鐵鐵蛋白可以通過還原釋放機制將鐵核釋放到外界環境或者由工程菌如大腸桿菌直接生產[12-13]。研究表明，上述2種脫鐵鐵蛋白均具有自組裝活性，即鐵蛋白在極酸/堿(pH≤2.0或pH≥10.0)條件下，蛋白殼亞基之間會發生解離，將pH值調至7.0左右時，解離的亞基又能自組裝成完整的鐵蛋白外殼。另外，由于良好的均一性、單分散性、熱穩定性和生物相容性等，使其常用作智能的納米載體，用于藥物的遞送以及營養成分的封裝。

天然鐵蛋白本身可以作為一種吸收利用率極高的生物補鐵源。此外，一些學者基于鐵蛋白的可逆組裝特性以及環境響應的通道“門控”特性(即擴大鐵蛋白外殼上的通道)成功包埋了蘆丁、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、姜黃素、綠原酸和蝦青素等食品生物活性物質，顯著提高了活性物質的穩定性、生物利用度及水溶性等，擴大了鐵蛋白在食品工業以及食品營養領域的應用[14]。不同于人重鏈鐵蛋白(human H-chain ferritin，HuHF)，日本囊對蝦鐵蛋白(Marsupenaeusjaponicusferritin，MjF)是一種潛在的可以去除污染食品系統中的重金屬離子的食物源蛋白，主要是由于2種鐵蛋白的半胱氨酸(Cys)殘基位置不同：HuHF的Cys殘基位于蛋白殼外，而MjF的Cys殘基位于蛋白殼內。MjF能更好地結合鎘(Cd2+)及汞(Hg2+)等重金屬離子。因此，使用重組日本囊對蝦鐵蛋白(recombinantMarsupenaeusjaponicusferritin，rMjF)工程菌大批量純化重組蝦鐵蛋白是十分必要的。

對于鐵蛋白，常用柱層析進行進一步分離和純化，如張晨曦等[15]和丁炳文等[16]通過Sephacryl S-500(300)凝膠過濾層析及DEAE陰離子交換層析純化鐵蛋白。由于凝膠過濾層析、陰離子交換層析、親和層析等柱層析技術耗時長、過程繁瑣、成本高，因此很大程度上限制了其批量化生產。硫酸銨的水溶液具有極高的離子強度，可以使蛋白質與H2O隔絕，降低蛋白質的溶解度[17]。蛋白分子間的疏水作用會使其相互聚集形成沉淀，從而促使蛋白和其他雜質(如糖類等)分離[18-19]。此外硫酸銨還具有易溶解、價格低、純物質易獲得、對蛋白質結構穩定和飽和溶液的密度相對較低等優點[20]。飽和硫酸銨鹽析是重組鐵蛋白分離純化的一個重要步驟。本研究對重組蝦鐵蛋白的粗提取液進行20%～40%飽和度的(下同)硫酸銨處理(先采用20%飽和硫酸銨處理，收集上清液后將硫酸銨的飽和度提升至40%，收集沉淀復溶)后并結合透析、超濾等技術，成功制備出純的rMjF，為rMjF的應用研究提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

含日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)鐵蛋白質粒(pET-3a)的大腸桿菌[BL21(DE-3)]由中國農業大學趙廣華老師實驗團隊于2019年10月提供，于-80 ℃冰箱中凍存保藏。

1.2 儀器與設備

Scientz-ⅡD超聲細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；高速冷凍離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；高溫高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械有限公司；-80℃超低溫冰箱，美國Thermo公司；SW-CJ1F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；電泳儀、垂直電泳槽、凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；JEM 1200EX透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)，日本JEOL公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度儀，英國Malvern公司；YC-2層析冷柜，北京博醫康公司；Stirred Cell 8050/8003超濾裝置，美國Minipore公司；CPA225D十萬分之一電子天平，德國Sartorius公司；Nicoletl iS10傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo公司；ULUP-IV-10T超純水儀，四川優普超純科技有限公司；Vivaflow 200超濾膜包，德國Sartorius公司；TY-80A水平脫色搖床，江蘇科析儀器有限公司；WD-9406膠片觀測燈，北京六一儀器廠；THZ-98AB恒溫震蕩培養箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 含rMjF大腸桿菌的培養與破碎

參考DENG等[21]和MASUDA等[22]的方法，做一些改動。將凍存于-80 ℃的條件下的菌種活化，并將活化后的菌種接種于含氨芐青霉素(50.0 mg/mL)LB培養基(由超純水配制)中。在37 ℃，180 r/min，pH=7.5的條件下，培養至OD600為0.6左右，采用200 μmol/L 異丙基β-D-硫代半乳糖苷誘導表達8 h，在溫度為4 ℃，轉速為10 000 r/min的條件下，離心10 min收集菌體。將收集的菌體再次懸于超純水中進行超聲細胞破碎(功率250 W，超聲破碎30 min，開2 s，關3 s)，至菌液完全澄清。

1.3.2 rMjF的分離與純化

將破碎液進行加熱處理(65 ℃，10 min)，待熱敏蛋白變性后，離心(10 000 r/min，4 ℃，5 min)，收集上清液進行飽和硫酸銨處理。分別采用20%～40%(先采用20%飽和硫酸銨處理，收集上清液后將硫酸銨的飽和度提升至40%，收集沉淀用水溶解)、20%～60%(先采用20%飽和硫酸銨處理，收集上清液后將硫酸銨的飽和度提升至60%，收集沉淀用水溶解)和20%～40%～60%(將采用20%～40%飽和硫酸銨收集的沉淀用60%飽和硫酸銨溶液溶解)飽和硫酸銨復合處理rMjF。然后，將含目標蛋白的硫酸銨溶液置于超純水中進行透析(透析袋截留分子質量為300 kDa，每隔8 h更換1次透析液，共進行3次)除去硫酸銨。將透析后的液體經0.22 μm(聚醚砜材質)的濾膜進一步澄清，然后用膜包(截留分子質量50 kDa)超濾濃縮，最后進行冷凍干燥保存。

1.3.3 純度鑒定

參考劉文營[12]的方法，并做出一定的改進。采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)(濃縮膠的濃度為5%，分離膠的濃度為12%，80 V運行20 min后轉為120 V)測定rMjF的純度及其亞基的分子質量。

1.3.4 粒徑的測定

參考丁炳文等[16]的方法，進行rMjF的粒徑測定。使用馬爾文粒度儀(Zetasizer Nano ZS；美國賽默飛)在25 ℃下進行粒徑測試。

1.2.5 紫外掃描測定

參考張晨曦等[15]的方法，進行rMjF的紫外光譜表征。使用紫外掃描儀掃描220 ～400 nm下的紫外-可見光光譜。

1.3.6 納米結構觀測

參考張晨曦等[15]的方法，進行rMjF的納米結構觀察。純化樣品用20.0 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)稀釋至一定濃度后，將其放置于碳涂層銅柵上，用20 g/L醋酸鈾酰染色3 min，透射電子顯微鏡在80 kV處對其進行成像。

1.3.7 傅里葉-紅外光譜對rMjF二級結構的測定

參考丁炳文等[16]的方法，進行rMjF的紅外光譜測定。將純化的鐵蛋白溶液進行冷凍干燥，然后與充分干燥的KBr混合研磨后制片，以充分干燥的KBr為空白背景。具體參數設定如下：紅外光譜儀分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次。之后結合PeakFit v 4.12軟件對蛋白質的特征吸收帶酰胺Ⅰ帶進行rMjF二級結構分析。

1.4 數據處理

每個樣品做3次平行，數據結果取平均值，之后使用Origin 9.0軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 rMjF的分離純化

鐵蛋白是一種耐熱蛋白，其受熱展開的過渡溫度(Tm)約為70 ℃，遠高于一般蛋白質的Tm(50 ℃以下)，且有研究表明鐵蛋白外殼可以在80 ℃的高溫下持續10 min不變性[23]。所以本實驗通過65 ℃加熱10 min 處理rMjF破碎液去除部分不耐熱雜蛋白，之后進行飽和硫酸銨處理。鐵蛋白經過飽和硫酸銨處理后，存在于20%飽和度的硫酸銨的上清液中，同時存在于60%飽和度的硫酸銨的沉淀中[4,15]?；诖?，本實驗將熱處理后的rMjF粗提液上清液均分為3份，分別緩慢添加硫酸銨固體，使溶液中硫酸銨的最終飽和度達到20%、40%和60%，靜置30 min后，分別取其上清液和沉淀進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。

由圖1可知，rMjF由分子質量約為20 kDa的單亞基組成，與WANG等[24]對非重組的MjF的亞基分子質量基本一致。經過飽和度20%、40%和60%的硫酸銨處理后，rMjF分別存在于飽和硫酸銨溶液的上清液、沉淀和沉淀中，與前人的研究基本一致[4,15]。雜蛋白存在于經20%飽和硫酸銨處理后的沉淀中，這可能是由于rMjF的硫酸銨溶解度曲線符合典型的蛋白質的硫酸銨溶解度曲線[25]，即rMjF可以在低飽和度的硫酸銨溶液中溶解度增加(鹽溶)，在高飽和度的硫酸銨溶液中溶解度降低(鹽析)。所以可以采用20%飽和硫酸銨處理去除沉淀中部分雜蛋白，然后通過提升其上清液(硫酸銨的飽和度為20%)的飽和度進一步提純rMjF。

圖1 不同飽和度的硫酸銨處理rMjF粗提物的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of rMjF crude extract treated with ammonium sulfate at different saturation注：泳道1-20%飽和硫酸銨處理的上清液；泳道2-20%飽和硫酸銨處理的沉淀；泳道3-40%飽和硫酸銨處理的上清液；泳道4-40%飽和硫酸銨處理的沉淀；泳道5-60%飽和硫酸銨處理的上清液；泳道6-60%飽和硫酸銨處理的沉淀

采用考馬斯亮藍測定經60%、20%～40%、20%～60%和20%～40%～60%飽和硫酸銨處理的粗提液中蛋白濃度，與熱處理后的粗提液對比，蛋白濃度分別減少了29.67%、49.7%、36.94%和48.81%。結果表明，rMjF粗提液經過飽和硫酸銨復合處理會大大降低雜蛋白的含量。凌雪萍等[26]通過采用50%～80%的飽和硫酸銨處理乳鐵蛋白也得到了相同的結論。由圖2可知，粗提上清液經20%～40%、20%～60%和20%～40%～60%飽和硫酸銨處理后，結合透析、超濾等技術，三者rMjF純度都很高，即經過飽和硫酸銨復合處理結合非柱層析技術可以有效純化rMjF。PALOMBARINI等[4]也通過20%～40%飽和硫酸銨處理結合其他非柱層析技術成功純化了重組人重鏈鐵蛋白。

圖2 梯度飽和硫酸銨處理rMjF粗提物后的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of rMjF crude extract treated with gradient saturated ammonium sulfate注：泳道1-粗提液經20%～40%飽和硫酸銨雙重處理后，經透析、超濾后的蛋白質；泳道2-粗提液經20%～60%飽和硫酸銨雙重處理后，經透析、超濾的蛋白質；泳道3-粗提液經20%～40%～60%飽和硫酸銨的三重處理后，經透析、超濾的蛋白質

2.2 不同飽和度硫酸銨處理后的rMjF納米粒徑表征

由圖3可知，經過20%～40%和20%～60%飽和硫酸銨復合處理提純的rMjF與傳統層析(60%硫酸銨處理結合柱層析技術)的rMjF體積分布表明，rMjF球體的粒徑約為12 nm，這與鐵蛋白外殼徑12 nm 基本一致。但與傳統的層析處理相比，經20%～40%和20%～60%飽和硫酸銨復合處理提純的rMjF會發生一定的團聚現象。由圖3的插圖可以看出,經20%～40%～60%飽和硫酸銨的三重處理提純的rMjF團聚現象更嚴重。然而，目前對于硫酸銨復合處理引起鐵蛋白團聚的具體原因尚不清楚，需要之后進一步研究。為了減少鐵蛋白的團聚，本實驗對粗提液采用20%～40%飽和硫酸銨雙重處理提純的rMjF進行表征。

圖3 不同飽和度硫酸銨處理后的蛋白粒徑圖Fig.3 Protein particle size diagram after ammonium sulfate treatment with different saturation注：右上角的插圖為粗提液經20%～40%～60%飽和硫酸銨的三重處理提純的蛋白粒徑圖

2.3 rMjF納米結構觀察

由圖4可知，傳統層析與未層析(20%～40%飽和硫酸銨處理)純化的rMjF均具有較好的分散性及其粒徑的均一性。蛋白腔內存在黑色的鈾核，這主要是因為rMjF是脫鐵鐵蛋白，經乙酸鈾染色后，乙酸鈾會通過其外殼上的通道進入蛋白內部使腔內呈現黑色[27]。

a-層析制備的rMjF；b-非層析制備的rMjF圖4 純化后rMjF的TEM圖Fig.4 TEM images of purified rMjF

2.4 rMjF的紫外光譜分析

利用紫外掃描層析與未層析(20%～40%飽和硫酸銨處理)純化的rMjF。由圖5可知，rMjF的最大吸收峰位于280 nm，這主要是由于蛋白質分子中存在含共軛雙鍵的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸)，這些氨基酸在280 nm處有吸收峰。脫鐵之前的鐵蛋白由于鐵核的存在會干擾光譜的吸收沒有吸收峰[12]，此結果進一步表明rMjF是脫鐵鐵蛋白。

圖5 rMjF的紫外掃描圖Fig.5 UV scan of rMjF

2.5 紅外光譜分析rMjF二級結構

圖6 rMjF的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of rMjF

圖7 rMjF紅外光譜酰胺Ⅰ帶擬合圖Fig.7 Infrared spectra rMjF amide Ⅰ bands fitting figure

表1 酰胺Ⅰ帶擬合峰對應的二級結構[31]Table 1 Amide Ⅰ bands corresponding to the secondary structure

表2 紅外光譜酰胺Ⅰ帶擬合數據Table 2 Fitting data of amide I bands of infrared spectrum

3 結論

本研究對經過熱處理(65 ℃，10 min)后rMjF的粗提液進行20%～40%飽和硫酸銨處理，并結合透析、超濾等非柱層析技術，成功制備出純的rMjF。相較于離子交換層析等柱層析技術，本實驗中rMjF分離純化技術成本較低,易于操作,適用于工業化大批量生產,未來可考慮將rMjF作為納米載體裝載生物活性成分或者將其作為食品原料中重金屬離子的吸附蛋白。大批量生產rMjF具有重要意義和廣闊的開發前景。