云南泡藠頭和泡辣椒中細菌與真菌群落結構和多樣性分析

楊振光，任洪冰，蘇舒，劉秉珍，李莉蓉*，曹建新*

1(昆明理工大學 農業與食品學院，云南 昆明，650500)2(紅河宏斌食品有限公司，云南 紅河，654300)

藠頭是百合科的多年生宿根性草本植物，辣椒是茄科辣椒屬植物，在我國主要產地集中于云南四川和湖南等地，發酵后的藠頭和辣椒具有優秀的抗菌、抗缺氧和免疫調節功能[1-2]。此外，發酵后產生的乳酸及有機酸能夠提高食欲，促進胃腸消化[3]。泡藠頭與泡辣椒作為自然發酵的蔬菜制品，具有豐富的微生物群系，泡藠頭和泡辣椒中的微生物主要來源于環境和原料表面[4]。泡藠頭和泡辣椒中微生物種群的構成與原料、環境以及制作工藝等因素密切相關[5]。研究表明，乳酸菌為主要優勢菌群[4-6]，其對泡藠頭和泡辣椒風味品質的形成具有重要的作用[7]。乳酸菌及其混合發酵產生的酸和醇是形成酯類化合物 (藠頭香氣) 的主要來源[8]。研究發現，泡藠頭與泡椒發酵液中富含戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、食果糖乳桿菌(Lactobacillusfructivorans)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)等乳酸菌[9-11]。其中植物乳桿菌具有較強的產酸能力與耐鹽性，可作為腌漬藠頭和辣椒的發酵菌種[12]。

相較傳統的純化培養技術，高通量測序技術實現了不同樣品間微生物菌群的比較分析。目前關于高通量測序技術在發酵辣椒和藠頭的微生物多樣性分析中的應用報道較少，關于云南腌漬辣椒和藠頭的細菌和真菌多樣性研究更是尚未發現。

本研究采用高通量測序技術對昆明、文山和紅河地區的腌漬藠頭和辣椒中細菌和真菌菌落結構進行分析，以期為后續腌漬藠頭和辣椒等特色泡菜制品的微生物多樣性研究提供一定的數據參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣品與試劑

1.1.1 供試樣品

腌漬藠頭、辣椒：采自云南省文山州、紅河州和昆明市的農貿市場，共采集樣品5種，分別標記為文山泡藠頭(WJ)、文山泡辣椒(WL)、紅河泡藠頭(HJ)、紅河泡辣椒(HL)、昆明泡藠頭(KJ)。

1.1.2 試劑

基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR試劑盒、Manual_XLR70試劑盒，Qiagen公司；TruSeq測序配套試劑，北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Illumina NovaSeq6000測序平臺、JY04S-3C型凝膠成像分析系統、JY600C型核酸電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司；TGL-16aR型冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

分別于云南省文山州、紅河州和昆明市的農貿市場對腌漬藠頭和辣椒進行采集，裝入樣品袋中低溫保存運回實驗室。

1.3.2 基因組DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)或十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)提取的方法對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。

1.3.3 PCR擴增及Illumina測序

對樣品基因組進行擴增，引物序列為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)擴增細菌16S rDNA V3～V4區。對樣品基因組擴增，引物序列為5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和5′-TGCGTTCTTCATCG ATGC-3′擴增真菌ITS1(ITS1～ITS2)區。

所有PCR反應均使用15 μL Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs)、0.2 μmol/L正反向引物和約10 ng模板DNA進行。PCR擴增條件為95 ℃預變性30 s，循環1次，95 ℃變性15 s，60～72 ℃退火15 s，72 ℃延伸30～60 s，循環30次，最后72 ℃ 再延伸15 min。將等量的1×負載緩沖液(含SYB green)與PCR產物混合，使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，寄往北京諾禾致源科技股份有限公司完成高通量測序，測序平臺為Illumina NovaSeq6000。

1.3.4 數據分析

測序完成后,按照目的片段的大小,剔除質量不合格的原始序列,對合格的序列進行拼接。按照97%相似度閾值進行分類,建立操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)，通過核糖體數據庫項目樸素貝葉斯算法鑒定OTU種系型?；诩毦郝涞慕M成,在門和屬兩個水平上進行樣品的細菌多樣性分析。同時，對OTUs進行豐度、α多樣性計算等分析，以得到樣本內物種豐富度和均勻度信息、不同樣本或分組間的共有和特有OTUs信息等。使用Origin 8.5軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 泡藠頭和泡辣椒的細菌菌落組成

通過對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，統計各個樣品門和屬水平的菌落組成，根據各樣品不同屬的細菌所占比例作圖,并將相對豐度<0.1%的部分合并為其他(other)。不同地區泡藠頭和泡辣椒細菌相對豐度占比如圖1和圖2所示。

圖1 泡藠頭和泡辣椒樣品中細菌門水平分布圖Fig.1 Phylum level distribution of bacteria in pickled Chinese onion and pickled pepper

圖2 泡藠頭和泡辣椒樣品中細菌屬水平分布圖Fig.2 Genus level distribution of bacteria in pickled Chinese onion and pickled pepper

如圖1所示，基于OTU結果表明，厚壁菌門(Firmicutes)、變形桿菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為泡藠頭和泡辣椒的主要共有菌門。其中，厚壁菌門和變形桿菌門為優勢菌門，相對豐度占比分別為50.61%、58.07%、53.13%、99.20%、11.97% 和47.36%、35.63%、44.96%、0.58%、58.18%。此外，當樣品中變形桿菌門相對豐度升高時，厚壁菌門相對豐度降低；其中WL中變形菌門比例最高，達到了58.19%；另外，WL中放線菌門和擬桿菌門相對豐度為16.83%和10.42%，與LIANG等[13]的研究結果一致。向凡舒等[14]運用高通量測序技術對腌制蔬菜的細菌菌群結構分析結果表明其優勢細菌門也為厚壁菌門。綜上所述，泡藠頭和泡椒的菌落結構相似，但相對豐度差別較大。

如圖2所示，泡藠頭和泡辣椒樣品中相對豐度>1%的細菌有17個屬，包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)等乳酸菌和假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)等常見致病菌。其中，WJ中乳酸桿菌屬的相對豐度最高，占比為98.07%，明顯高于其他樣品；在不同地區的泡藠頭和泡辣椒樣品中明串珠菌屬相對豐度占比為0.02%～19.46%，KJ中明串珠菌屬相對豐度占比最高，為19.46%；在HL和HJ中魏斯氏菌屬相對豐度占比較高，分別為8.96%和17.70%。研究表明，乳酸菌在促進蛋白質分解為脂肪酸和改善風味方面具有很大優勢，這大大延長了泡辣椒和泡藠頭的貯藏期并且具有良好的風味[15]。此外既往研究結果得出，發酵蔬菜中的乳酸菌大多數來自于乳酸桿菌屬，這與本研究結果相符[16-21]。另外JEONG等[22]研究表明韓國發酵蔬菜中乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬豐度較高，造成不同地區泡藠頭中乳酸菌類群存在差異的原因除與原料種類有關外，還與地域和制作工藝等諸多因素有關。

2.2 泡藠頭和泡辣椒的真菌菌落組成

根據OTU結果，對泡藠頭和泡辣椒中每個樣品中真菌OTU進行分類學分析，進而研究泡藠頭和泡辣椒中的真菌菌落的組成，真菌綱水平和屬水平分析結果如圖3和圖4所示。

圖3 泡藠頭和泡辣椒樣品真菌綱水平的分布圖Fig.3 Class level distribution of fungi in pickled Chinese onion and pickled pepper

圖4 泡藠頭和泡辣椒樣品真菌屬的分布圖Fig.4 Genus level distribution of fungi in pickled Chinese onion and pickled hot pepper

如圖3所示，泡藠頭和泡辣椒樣品中真菌在綱水平上，共檢測到酵母菌(Saccharomycetes)、座囊菌(Dothideomycetes)和傘菌(Agaricomycetes)。其中，酵母菌在KJ、WJ、HJ和WJ中占比>75%。這表明，泡辣椒和泡藠頭樣品的優勢真菌門為酵母菌，這可能與其較高的食鹽耐受力有關。李恒等[23]研究表明，發酵蔬菜樣品中優勢真菌門為酵母菌，與本實驗研究的結果相同，酵母菌被認為是傳統發酵泡菜中的主要真菌。

由圖4可知，泡藠頭和泡辣椒樣品中相對豐度>1%的真菌有8個屬，分別為接合酵母菌屬(Zygosaccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、阿薩希絲孢酵母屬(Trichosporon)、漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、念珠菌屬(Candida)、孢子菌屬(Mycosphaerella)、環孢菌(Torulaspora)和枝孢菌(Cladosporium)。其中，WL、WJ、HJ和HL中接合酵母菌屬為優勢菌種，相對豐度占比分別為60%；KJ中畢赤酵母屬為優勢菌種。有研究報告指出，采樣地點不同和原料不同的發酵蔬菜樣品的優勢真菌均為接合酵母菌屬[24]。而本研究也首次發現阿薩希絲孢酵母屬在泡藠頭或泡辣椒中作為主要真菌屬，阿薩希絲孢酵母屬多見于溫熱地區，是一種常見致病酵母菌[25-26]，可能由于發酵時氣候炎熱，導致出現真菌感染，其在泡藠頭和泡辣椒的作用特性和危害有待進一步探索。

2.3 OTUs分類學分析及多樣性分析

2.3.1 OTU聚類統計

如表1和表2所示，在OTU劃分的基礎上，所有真菌序列劃分為133個門、316個綱、488個目、851個科和1 342個屬；所有的細菌序列則被劃分為133個門、316個綱、488個目、851個科和1 342個屬。

表1 樣品真菌群落各分類地位數量 單位：個Table 1 Number of fungal communities in each taxonomic position

表2 樣品細菌群落各分類地位數量 單位：個Table 2 Number of bacterial communities in each taxonomic position

由圖5-a可知，5個樣品中共有真菌OTU數量為178，而樣品KJ、WL、WJ、HL和HJ中特有的真菌OTU數量分別為1 065、614、609、570和671，說明昆明地區的泡藠頭中的真菌群落多樣性高于其他2個地區。由圖5-b可知，5種泡菜樣品中共有細菌OTU有110個。在不同樣品組間獨有細菌OTU數量也存在差異，其中，WL的OTU數量最多，有341個，WJ的OTU數量最少，有17個；而HJ、HL和KJ的OTU數量分別為195、67和151個。表明在文山地區的的泡藠頭和泡辣椒間細菌種類存在差異。綜合分析，在3個地區的泡菜樣品中細菌的OTU數量明顯少于真菌的OTU數量。

a-真菌；b-細菌圖5 微生物群落維恩圖Fig.5 Venn diagram of microbial community

2.3.2 α-多樣性分析

α多樣性分析能夠表示樣品中微生物的豐富度與均勻度，其中Chao1指數能夠評價微生物菌落的豐富度，其值的大小隨著菌群豐富度的升高而增加；Shannon指數和Simpson指數在反應微生物菌落豐富度的基礎上還能夠反應樣品中菌落結構均勻度，Shannon指數和Simpson指數隨著微生物菌落豐富度與均勻度的升高而增大[13]。

由表3可知，就真菌而言，在5種樣品中HJ的Chao1指數和Shannon指數最高；KJ的Chao1指數最低，WL的Shannon指數最低。這說明HJ樣品具有最高的真菌物種多樣性和均勻度，而KJ樣品的真菌物種多樣性最低，WL的真菌物種均勻度最低。

表3 真菌生物多樣性指標Table 3 Indicators of fungal biodiversity

由表4可知，通過Chao1、Shannon和Simpson指數對泡藠頭和泡辣椒樣品中細菌的菌群多樣性和豐度進行了比較。其中，WL的Chao1、Shannon和Simpson指數均高于其他各樣品組，WJ的Chao1、Shannon和Simpson指數最低；此外泡辣椒樣品的Shannon和Simpson指數均高于泡藠頭樣品。結果表明，泡藠頭中的細菌菌群豐度與多樣性高于泡辣椒，并且文山地區泡辣椒的細菌的菌群多樣性顯著高于其他地區。由此我們可以推斷，泡辣椒和泡藠頭中細菌菌群豐度和多樣性隨著環境原料的變化而改變，文山地區由于其環境因素，泡藠頭中的細菌多樣性顯著高于其他各組樣品。

表4 細菌生物多樣性指標Table 4 Indicators of bacterial biodiversity

2.3.3 不同地區樣品間物種組成分析

為進一步確定泡菜產地和泡菜種類對泡菜中細菌和真菌菌落結構的影響因素，通過采用OTU水平非加權UniFrac距離的主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類堆疊樹狀圖對5種泡菜樣品的β多樣性進行進一步的比較分析。

PCA作為評價微生物群落相似性的可視化方法，樣本間的距離越近，微生物群落結構越相似。真菌群落PCA結果如圖6所示，紅河地區的泡辣椒和泡藠頭樣品主要分布在第1象限；昆明地區泡藠頭樣品分布在第2象限；文山地區的泡辣椒和泡藠頭樣品分布在第3和第4象限。3個地區的泡辣椒和泡藠頭樣品在PCA圖中的距離相差較遠，說明3個地區泡辣椒和泡藠頭樣品中細菌菌落的結構存在較大差異，其中紅河地區與文山地區的辣椒和泡藠頭樣品中細菌菌落的結構差異小于昆明地區泡藠頭樣品。

圖6 真菌主成分分析Fig.6 Principal component analysis of fungal

細菌群落PCA結果如圖7所示，3個地區的樣品間距離較遠，說明這3個地區樣品間細菌群落相似性較低；樣品HL和HJ在圖中距離較近，表明2個樣品間細菌群落結構相似度較高；樣品WL和WJ各自離散，說明2個樣品間細菌群落結構相似性低。

圖7 細菌主成分分析Fig.7 Principal component analysis of bacteria

為了能更加清楚的反應樣品中真菌和細菌群落結構的差異，通過聚類堆疊樹狀圖對5種樣品進行聚類分析。真菌聚類堆疊樹狀圖如圖8所示，5種樣品可分為2個大類，其中昆明地區泡藠頭為一類，而文山和紅河地區的泡辣椒和泡藠頭聚類為一類，該結果與PCA結果相似。

細菌聚類堆疊樹狀圖如圖9所示，5種樣品中，HL和HJ為一類，其余3種樣品各自為一類，這與PCA結果基本一致。從泡辣椒和泡藠頭真菌群落的β多樣性分析結果來看，不同地區的泡辣椒和泡藠頭相似度差別較大，這可能與地域差異性導致的微生物群落的核心類群不同有關。

圖9 基于OTU水平的細菌聚類分析Fig.9 Cluster analysis of bacteria based on OTU level

3 結論

本研究利用高通量測序技術分析了云南省昆明市、文山州和紅河州的泡藠頭和泡辣椒中細菌和真菌的菌群構成及相對豐度。結果表明，樣品中優勢細菌類群主要是由隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)構成；優勢真菌類群主要是由接合酵母菌屬(Zygosaccharomyces)和畢赤酵母菌屬(Pichia)構成。通過對比昆明市、文山州和紅河州的泡藠頭和泡辣椒微生物結構，發現文山州泡藠頭和泡辣椒細菌群落結構種類多樣性及豐度要顯著高于其他地區，紅河州的泡藠頭和泡辣椒真菌群落結構種類多樣性及豐度要顯著高于其他地區。