轉錄組學技術在人參皂苷生物合成途徑研究中的應用進展

季宏與，丁常宏，于丹，都曉偉

(黑龍江中醫藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱，150040)

人參(PanaxginsengC.A.Mey.)是一種來自五加科(Araliaceae)人參屬的多年生草本植物[1]，至今已有兩千年的藥用歷史。根據現代研究表明，人參具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用，可用于心腦血管系統、免疫系統及神經系統等疾病的治療，同時能夠改善記憶力，降疲勞，有益于人體健康[2-7]。目前，人參作為一種極具藥用價值的名貴中藥材，已成為全球最暢銷的中草藥產品之一，越來越廣泛的應用于各種食品、保健品和藥品中。其中，人參皂苷作為人參的主要生物活性成分，到目前為止，已經從中鑒定出超過150種人參皂苷，包括Rh1，Rs1，Rh2，Rk2，Rf，Rg3等[8]。由于其存在復雜結構及較長合成路徑的難題，人工合成人參皂苷非常困難[9-10]?；诖?，如何提高人參種質品質以及促進人參皂苷成分的體外生物合成等成為科研工作者研究的熱點問題，而轉錄組學研究方法可以為人參皂苷生物合成提供大量的候選基因，并為后期的研究奠定基礎。

20世紀90年代，各種組學技術日新月異，作為生物信息學的前沿研究手段，轉錄組學是發展最早，應用最廣泛的技術之一[11]，在一定程度上對基因的研究模式產生了影響，將基因組學帶入了一個新的高速發展時期。近年來，隨著技術的飛速發展和不斷更新，轉錄組研究取得了巨大進步，尤其是在研究特定組織或特定生理條件下表達的基因信息，采用轉錄組測序技術可以高效、簡便、快速的進行獲取，對于人參藥用植物研究中發現功能基因、分析代謝途徑以及闡明調控機理具有重要意義[12]?；诖?，本文通過文獻的查閱和整理，對轉錄組學研究方法、新技術及在挖掘人參皂苷生物合成途徑相關基因應用上的研究進展進行綜述，以期為人參的深入研究提供有價值的參考。

1 轉錄組學研究方法

轉錄組這一概念是在1995年VELCULESCU等[13]對酵母菌基因表達進行研究時首次提出的。轉錄組狹義上通常是指細胞中所有參與蛋白質翻譯的信使RNA(messenger RNA,mRNA)[14]。轉錄組學以樣品中的全部轉錄本為研究對象，從群體水平上研究功能基因的表達水平及轉錄調控規律。已經在生物前沿研究，如動植物基礎研究、微生物、臨床診斷和中藥產品研發等領域得到了越來越廣泛的應用[15-18]。目前，轉錄組學研究技術主要分為兩大類，一類是以雜交方法為基礎的微陣列技術，另一類是以測序為基礎的轉錄組測序技術，兩種技術在人參皂苷合成代謝的研究中都有應用。

1.1 微陣列基因芯片技術

微陣列基因芯片技術最早是在1991年由FODORS等首次提出，是當時影響最深遠的重大科技進展之一[19]。該技術是將核酸片段作為分子探針，使其固定于載玻片等載體支持物上，與熒光標記的樣品進行雜交，通過雜交信號強弱，獲得樣品相關的生物信息[20]。但是，該技術在應用過程中仍然存在許多不足，如基因芯片技術存在假陽性，特異性低，檢測系統靈敏度低，樣品制備繁瑣，使用成本較高等，限制了其應用的普及。

1.2 轉錄組測序技術

1.2.1 表達序列標簽技術、基因表達序列分析技術及大規模平行測序技術

目前轉錄組測序技術是人參轉錄組學分析研究的重要手段，根據其技術發展水平可分為三階段，即第一代測序技術、第二代測序技術和第三代測序技術[21]。最開始發展起來的表達序列標簽技術、基因表達序列分析技術和大規模平行測序技術都為轉錄組學研究中的第一代測序技術，主要以Sanger測序方法為基礎，從整體水平研究動植物組織中生物表達信息，其基本原理是將mRNA反轉錄的互補DNA (complementary DNA,cDNA)兩端的一段序列作為序列標簽來反映基因的表達水平[22]。最初，研究人員使用Sanger方法對轉錄組進行測序，并通過序列分析比對來研究參與人參皂苷生物合成途徑的基因[23]。但是，這些傳統的測序方法由于成本高、耗時長，測序通量低等缺點已不是人參轉錄組測序的最佳分析方法[24-25]。

1.2.2 RNA-Seq技術

轉錄組學的第二代測序技術，即RNA-Seq技術可以直接對沒有基因信息物種的轉錄組進行分析，更深入的獲得幾乎所有轉錄本信息[26]，彌補了非模式植物轉錄組研究中缺乏基因組信息的不足，基于轉錄組研究可以進行基因組映射，有助于研究基因的表達情況。該技術具有更高的檢測通量，更高的分辨率、靈敏度，以及更廣的檢測范圍等優勢，也是目前深入研究人參轉錄組應用最廣的轉錄組測序方法[27]。RNA-seq測序的平臺主要包括Roche公司的焦磷酸測序平臺、Illumina公司的Illumina/Solexa平臺和Applied Biosystems公司的SOLID平臺[28-29]。這3種測序平臺中的Illumina/Solexa平臺展現出顯著優勢，具有所需樣品量少、測序通量大、準確率高、測序費用低的優點。它的不足，如序列有效讀長較短、運行時間較長也在逐步改善，成為當前人參轉錄組研究的首選測序平臺。隨著第二代測序技術的應用，在解析人參皂苷合成途徑、代謝網絡和基因間相互作用方面不斷取得新進展。

1.3 納米孔單分子測序技術和單分子實時測序

與第一、二代測序技術相比，第三代納米孔單分子測序技術和單分子實時測序能對全長轉錄組進行研究，在新轉錄本發現上具有明顯優勢，其具有無需PCR擴增、測序通量高、超長讀長和所需樣品量少等優點[30-31]。但是，由于第三代測序技術存在測序信號弱的缺點，易導致堿基識別過程中產生隨機錯誤，增加了測序成本等難題，目前仍處于優化階段[32-33]。

2 轉錄組學的前沿新技術

2.1 單細胞轉錄組測序技術

隨著第一、第二、第三代測序技術的不斷更替和發展，目前，轉錄組測序已經不限制于組織和器官樣本的研究，單細胞轉錄組測序(single-cell RNA sequencing,scRNA-Seq)技術的出現，實現了對單細胞樣本的分析，可以通過從單個細胞中提取轉錄組數據來分析基因表達異質性。這使我們能夠對每個細胞進行區分和表征，揭示細胞動態過程，從而識別稀有細胞群，是轉錄組研究的技術性突破。單細胞轉錄組測序技術是由TANG等在2009年對小鼠的單個卵裂球細胞進行轉錄組研究時首次創立并應用[34]，研究中scRNA-Seq技術可以大幅度提升基因檢測通量，為擴大細胞數量和兼容實現高通量RNA測序開辟了一條新途徑。此后，單細胞RNA測序技術不斷得到改良和開發，在過去十年中，單細胞轉錄組測序技術在樣本收集、單細胞捕獲、條形碼反轉錄、cDNA擴增、文庫制備、測序和生物信息學分析方面不斷取得新進展，測序成本大大降低，有效信息量獲取逐漸增加，實驗效率顯著增強，已成為轉錄組學研究的強大工具[35-38]。單細胞RNA-seq技術在小鼠和人類的單細胞研究中正處于快速發展階段，先后應用于胚胎早期發育、組織器官發育、免疫學及腫瘤疾病等領域[39-42]。然而，對植物的單細胞分析仍處在初始階段，目前見于擬南芥、玉米、水稻、楊樹、番茄和花生等模式植物、農產品或經濟作物的研究中。主要通過高分辨率單細胞轉錄圖譜，發現細胞異質性，用于鑒定植物細胞類型，解析細胞發育軌跡，挖掘參與植物發育的候選基因等[43-44]。預期未來在人參等藥用植物活性成分的生物合成機理解析方面具有較大的應用空間。

2.2 空間轉錄組技術

在2020年，空間轉錄組技術被Nature雜志推選為年度最有價值的新技術，無一不證明空間轉錄組技術應用的重要性?？臻g轉錄組技術是將組織學成像和RNA測序相結合，以同時定量和定位細胞的基因表達，可視化識別組織區域中RNA分子的圖譜[45]，主要包括顯微切割技術、原位捕獲技術、原位雜交技術和原位測序技術。隨著這些技術的不斷發展和完善，檢測的通量、轉錄本數目和空間分辨率等不斷提高，空間轉錄組技術已成為一種實現新型生物學分析的手段[46-47]。相較于在哺乳動物組織應用中的不斷發展，空間轉錄組在植物上的研究并不多見，由于植物組織切片中細胞壁、葉綠體和液泡等細胞結構的存在，使轉錄分析復雜化，為空間轉錄組研究帶來挑戰[48]。該技術在植物中應用是通過獲得高分辨率的位置信息，解析植物細胞類型特異性基因表達情況，闡述細胞的獨特空間發育軌跡，可用于實現作物的改良[49]。目前，空間轉錄組技術在挖掘人參皂苷生物合成基因的應用研究還未見相關報道。由于植物細胞壁結構的存在，使大量細胞從組織中分離出來難度較高，但若能突破細胞解離困難的限制，將這兩種前沿新技術在人參轉錄組研究中進行應用，有望獲取大量細胞異質性信息及空間位置信息，解析人參組織在特定空間位置中各類細胞的分化軌跡和功能基因的特異性表達，將會為揭示人參次級代謝物的生物合成途徑提供新藍圖。

3 人參皂苷生物合成的相關基因

如何獲取大量人參植物的主要活性成分人參皂苷已成為科研工作者研究的熱點。轉錄組測序技術的出現，為大規模生產人參皂苷成分，揭示人參皂苷生物合成途徑提供了重要的基因資源。同時，隨著轉錄組學技術的發展，轉錄組學同其他組學(如代謝組學、蛋白質組學和基因組學等)的多組學聯用技術在人參植物研究領域中也得到了廣泛應用，通過多組學的整合分析，實現對人參功能分子表達模式精確量化，多視角闡述人參次級代謝物多樣性合成的復雜分子機制，為篩選影響人參次級代謝物合成的相關基因提供了有利手段和新思路。目前，已有許多科研工作者研究人參皂苷生物合成途徑的相關文獻，對其合成路徑也有了大體的推斷，見圖1。其生物合成過程中大約有20余步連續的酶促反應，但是只有少數參與該過程的酶基因被克隆，如角鯊烯環氧化物酶(squalene epoxidase，SE)[50]、達瑪烯二醇-Ⅱ合酶(dammarenediol-Ⅱ synthase，DS)[51]，β-淀粉樣蛋白合酶(beta-amyrin synthase，β-AS)[52]、UDP-葡萄糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferase，UGT)[53]和細胞色素P450(cytochrome P450s，CYPs)[54]等。因此，應用轉錄組學技術或聯合其他組學技術挖掘參與人參中次級代謝物合成途徑涉及的相關基因，對提高人參藥材品質及人參皂苷產量具有深遠意義。

3.1 參與第一階段合成反應的基因

據研究，人參皂苷的生物合成過程需要通過3個階段。第一階段是基于自身的甲羥戊酸(mevalonate,MVA)途徑和甲基赤蘚醇磷酸(methyl erythritol phosphate,MEP)途徑代謝產生異戊烯基二磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和二甲丙烯二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)，是人參皂苷前體物質的合成階段[55-56]。3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)作為上游的關鍵限速酶，是MVA通路中的調節靶點，HMGR表達上調可以影響人參中人參皂苷的合成效率，在人參皂苷生物合成的第一階段發揮重要的作用[57]。XUE等[58]采用第二代測序技術，對人參不同部位樣品進行了測序分析，研究發現，有380個參與人參皂苷生物合成以及編碼MEP途徑和MVA途徑酶的基因，通過基因表達譜分析，2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶 (2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyl transferase，IspD)可能是MEP途徑合成人參皂苷的關鍵酶。并首次揭示MEP途徑的基因轉錄豐度與人參根中MVA途徑的基因轉錄豐度相似，這是第一次根據人參樣品的轉錄組數據鑒定整個途徑中的所有基因，為人參皂苷代謝途徑研究提供了新的生物信息。此外，ZHANG等[59]采用代謝組學及轉錄組學聯用技術，分別對人參各部位的人參皂苷含量進行測定，對人參周皮、皮部、中柱組織進行測序研究，組裝了182 881個獨立基因，通過加權基因共表達網絡分析(weighted correlation network analysis,WGCNA)發現其中有21 178個獨立基因與人參皂苷的含量呈正相關，MVA通路中的大多數轉錄本在3個組織中均有不同程度的表達。與萜類合成相關的HMGR，磷酸甲羥戊酸激酶(phosphomevalonate kinase,PMK)，異戊烯二磷酸δ異構酶(isopentenyl-diphosphate delta-isomerase,IDI)在人參周皮中的表達量明顯高于人參皮部和中柱的表達量，該表達譜的異同有助于提高對人參皂苷在不同組織中合成、積累和運輸調控網絡的理解。

3.2 參與第二階段合成反應的基因

第二階段為三萜骨架生物合成階段，包括人參皂苷C骨架延長和母核苷元形成。首先IPP和DMAPP在法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)作用下，發生縮合反應生成法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate,FPP)，之后FPP在法尼基焦磷酸合成酶(squalene synthase,SS)催化下生成鯊烯，在此過程將母核苷元C骨架分別延長至15碳和30碳，其中FPS和SS是鯊烯結構合成中發揮重要作用酶基因[60]。之后鯊烯在SE作用下合成2，3-氧化鯊烯，在此基礎上，母核苷元骨架環化過程中的關鍵酶基因DS和β-AS的催化反應直接影響人參皂苷苷元的類型和最終結構，分別形成為達瑪烷型人參皂苷的四環骨架及齊墩果烷型人參皂苷。劉璐[61]在課題研究中，對人參代謝表達譜進行了分析，基于基因的差異性表達，從單基因數據集中鑒定出15個FPS，16個SE，9個β-As和85個UGTs，確定了相關候選基因。結果表明，多種關鍵基因的表達影響著人參皂苷的代謝途徑，對于促進多種單體人參皂苷的生物合成具有重要意義。YIN等[62]首次將不同年齡段人參的人參皂苷生物合成途徑中關鍵基因酶活性變化，基因表達與人參皂苷含量之間的關系進行了研究。結果發現，在2～4年參齡的人參中DS基因表達迅速增加，在4～6年基因表達保持穩定，并且DS酶活性與人參皂苷含量顯著相關。為我們提出了一種通過鑒定人參皂苷合成途徑中相關基因表達，酶活性與人參皂苷含量相關分析方法來識別人參根年齡的潛在新策略。另有相關研究通過采用“基因-皂苷含量”、“基因-基因”關聯分析的方法，以達到獲得參與人參皂苷生物合成候選基因的目的。王康宇等[63]基于人參轉錄組數據，對人參的候選基因PgDof表達量與單體皂苷和總皂苷含量及人參皂苷生物合成關鍵酶基因進行相關分析，獲得了與關鍵酶基因，如SE2_4、FPS_22、CYP716A53v2_1、DS_1、β-AS_6等互作顯著，得到了影響人參皂苷生物合成的重要候選基因PgDof-14-1，為挖掘候選基因提供了新思路。

a-MVA途徑、MEP途徑、三萜骨架生物合成及母核苷元的后修飾過程；b-部分三萜皂苷的生物合成途徑圖1 人參皂苷生物合成途徑及相關酶Fig.1 Ginsenoside biosynthesis pathway and related enzymes注:虛線箭頭為省略途徑；？為暫未闡明的酶；Glc：β-D-glucopyranosyl

3.3 參與第三階段合成反應的基因

第三階段是人參皂苷合成母核苷元的后修飾階段，細胞色素P450和糖基轉移酶(glyeosyltransferase，GT)已被證明在人參皂苷生物合成的最后步驟中起重要作用。在細胞色素P450和GT作用下，達瑪烯二醇發生羥基化和糖基化，在相應母核苷元C-3位、C-6位和C-20位進行修飾，可生成不同類型人參皂苷，這個過程的反應會對人參皂苷的生物學性質和功能產生影響。ZHAO等[64]利用轉錄組測序技術鑒定出100個PgCYP基因，經突變關聯分析發現，有6個PgCYP基因與人參皂苷生物合成顯著相關，確定為人參皂苷生物合成的候選基因，此發現為人參育種和人參皂苷生物合成研究提供了一套PgCYP基因SNP/InDel標記。在合成途徑中，細胞色素P450的表達情況也使不同活性成分皂苷在不同組織中具有不同含量。WEI等[65]綜合化學和轉錄組學對人參不同組織皂苷含量和關鍵酶基因進行分析，研究發現，地下組織中人參皂苷Re、Rb2、Rc、Rg1、Rd、R1、和Rb1的含量高于地上組織。地下和地上組織中分別有482個和882個獨立基因，經鑒定有75種不同表達的CYPs轉錄本。采用實時熒光定量(real time quantitative PCR，RT-qPCR)驗證分析，CYP716A47表達與地上組織人參皂苷Rc和Rb2的含量顯著相關。CYP716A47基因在地上組織中表達豐富，特別是在花中，其表達量比根部高31.5倍。CYP716A53v2基因主要與地下組織中人參皂苷Rd、Rb1、R1，Rg1和Re含量相關表達。這些研究為進一步研究人參皂苷合成、運輸和積累的機制提供了關鍵基因。

相較于參與第一、二階段合成反應中研究較為清晰的酶類，對人參皂苷糖基轉移酶的了解較少。糖基轉移酶是介導最終PPD型和PPT型皂苷生物合成中糖基化過程的酶，特定的基因家族UGT的表達情況豐富了皂苷的多樣性，然而，只有少數UGT因其底物特異性而被表征，并且許多在次級代謝物合成途徑中起關鍵作用的UGTs尚未被鑒定出來，這阻礙了皂苷多樣性的合成。KANG等[66]對茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)處理的不同時間段的人參不定根的UGT相關基因表達進行轉錄組研究，確定了11個候選UGT基因，包括8個新的UGT基因(Pg_S4174.10、Pg_S2390.5、Pg_S6708.3、Pg_S0804.16、Pg_S5977.4、Pg_S5521.1、Pg_S0245.36、Pg_S2351.7)和3個先前研究表征過的UGT基因(Pg_S4493.1，Pg_S4157.4和Pg_S4174.7)。同時，聯合代謝組學分析人參皂苷含量的時間依賴性變化，發現經MeJA處理引發了丙二?；藚⒃碥誖b1、Rb2、Rb3、Rc、Rd和七葉膽苷XVⅡ含量的增加，通過代謝分析和系統發育分析顯示，這些候選UGT基因與人參皂苷生物合成密切相關，有助于人參皂苷的糖基化。KHOROLRAGCHAA等[67]使用焦磷酸測序法從人參EST數據庫中篩選了12種可能參與三萜類化合物合成的UDP-糖基轉移酶，評估UGT(PgUGT)基因在4年生人參(花蕾，葉子，莖和根)組織中以及加茉莉酸酯衍生物處理的不定根的特異性表達。結果表明，與花蕾和莖相比，葉和根組織中大多數PgUGT顯示出較高的轉錄水平，與人參葉和根含有大量的次級代謝物相關。茉莉酸酯衍生物處理的人參不定根轉錄組測序結果發現，PgUGTs轉錄水平較未處理的對照組相比顯著提高，其中，PgUGT1基因和PgUGT2基因對茉莉酸酯衍生物特別敏感。LI等[68]利用454焦磷酸測序技術研究了人參的根莖葉花組織的轉錄譜，發現105 522個人參獨立基因，其中223個獨立基因參與人參皂苷骨架的合成。根據注釋結果預測了可能參與到人參皂苷合成途徑的326個潛在的細胞色素P450和129個潛在的UDP糖基轉移酶序列，這些基因的發現將有助于人參皂苷生物合成的分子機制研究。KIM等[69]通過轉錄組測序技術對MeJA誘導人參毛狀根培養物的轉錄譜進行研究，篩選出與人參皂苷生物合成相關的差異表達UGTs基因PG07029G02、PG07020C06和PG07025D04等。通過鑒定最終確定實現人參皂苷Rh2到Rg3轉化的UGRh2GT基因。此外，WANG等[70]基于轉錄組研究，采用基因表達和性狀關聯分析方法，篩選出7個與人參皂苷Rg3生物合成相關的基因，這些基因在MeJA誘導下的表達序列為FPS→UGT71A27_2，CYP339→PgRb3S03→PgRb3S10→PgRb3S01，該序列可能代表了Rb3合成和轉運的物質代謝過程，為人參皂苷Rb3的合成機理研究提供了理論依據。

4 展望

隨著測序技術的不斷完善，轉錄組學技術成為獲得人參大規?；蛸Y源的熱點研究技術，已在參與不同階段人參皂苷生物合成反應過程中基因的發現上取得了一定成就。但是，現階段的這些研究成果僅限于對選定的人參組織進行整體轉錄組測序，獲得的是細胞群體中單個基因的平均表達水平，未能從單細胞水平對其進行深層次了解。隨著新技術的發展，單細胞轉錄組和空間轉錄組技術在動植物的研究中取得了成功的經驗，若將這些前沿技術整合應用于人參植物的研究，有望在單細胞層面上獲得基因在空間位置中的差異表達信息，發現細胞間的異質性，了解不同類型細胞功能、細胞譜系發育軌跡，挖掘參與人參皂苷生物合成途徑的相關基因。同時，多組學聯用是獲得藥用植物綜合全面生物學信息的有效途徑，將前沿轉錄組學技術同蛋白質組學和代謝組學技術聯用，從多角度對人參生物學信息進行分析，通過轉錄組學的前沿技術掌握人參植物的細胞空間位置及基因表達信息，明確參與人參皂苷生物合成途徑相關基因的差異表達情況，再聯合應用蛋白質組學和代謝組學的相關技術，從蛋白質組學水平研究人參代謝物和人參皂苷生物合成相關基因翻譯調控關系，從代謝組學水平分析人參中人參皂苷成分變化。最終確定人參皂苷合成途徑及關聯酶，探究參與人參中人參皂苷生物合成路徑的調控位點，揭示人參皂苷合成機制，為大規模提高人參皂苷產量與活性提供一個新的方向。