黑果枸杞汁對大鼠酒精性肝損傷的保護作用*

胡 戈，曹建民，周海濤，張 靜，田一鳴，宋瀅洋，蔣若雨

（1.常州大學 體育學院，常州 213164；2.北京體育大學 運動人體科學學院，北京 100084；3.北京聯合大學，北京 100101；4.北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

我國飲酒人群比例和酒精性肝病患病率均呈現上升趨勢，嚴重危害人民健康［1］。慢性炎癥是酒精性肝病發生、發展的關鍵誘因，薈萃研究表明，慢性酒精攝入可導致Toll樣受體4（toll-like receptors4，TLR4）/p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信號激活，從基因水平增加多種促炎細胞因子表達，繼而誘發肝臟損傷［2］。黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）具有多種活性成分，以往研究多聚焦于其抗氧化作用［3，4］。相關研究表明，黑果枸杞具有降低血清炎癥因子水平，保護肝臟結構和功能的潛在作用［5］。本研究通過建立酒精性肝損傷大鼠模型，探討黑果枸杞汁通過介導TLR4/p38 MAPK信號通路，進而調節炎性因子水平，預防和緩解酒精性肝損傷發生與發展，保護肝臟結構和功能正常的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

60只SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體重170～200 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證編號：SCXK（京）2019-0010。北京體育大學SPF級動物實驗室飼養，溫度20～24℃，相對濕度55%～75%，正常晝夜節律。經7 d適應性飼養后，隨機分為5組：對照組（C）、模型組（M）、低劑量黑果枸杞汁組（LLM）、中劑量黑果枸杞汁組（MLM）、高劑量黑果枸杞汁組（HLM），每組12只。

1.2 儀器

主要儀器包括RM 2016病理切片機（德國Leica公司）；Pannoramic MIDI病理切片掃描儀（匈牙利3D HISTECH公司）；BX51F32H01光學顯微鏡（日本Olympus Corporation）；DR-200BS酶標分析儀（無錫華衛德朗儀器有限公司）；Allegra 25R臺式高速離心機、AU480生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.3 模型建立與營養干預方案

1.3.1 酒精性肝損傷模型建立［6］62°牛欄山二鍋頭，稀釋成400 g/L乙醇溶液，M組、LLM組、MLM組和HLM組灌胃劑量8 g/（kg·d），體積20 ml/kg，于13：00和19：00分2次完成，C組灌胃等體積蒸餾水，每日進行。

1.3.2 營養干預方案 黑果枸杞汁（原花青素2.08%，多糖4.9%，總花色苷3.2%，深圳金瑞豐生物科技公司提供）。LLM組、MLM組和HLM組分別以2.4、4.8和9.6 ml/（kg·d）（相當于人體推薦劑量的0.5、1.0、2.0倍）進行黑果枸杞汁灌胃，C組和M組灌胃等體積蒸餾水，灌胃時間為每日上午9：00。

1.4 實驗動物取材

實驗共4周，末次灌胃后24 h，烏拉坦麻醉大鼠后稱取體重，腹主動脈取血，室溫自然凝固，4℃離心10 min，3 000 r/min，提取血清，-20℃保存。取出肝臟，置于預冷生理鹽水沖洗，吸干后稱重。切取合適大小肝左葉，4%多聚甲醛固定。其余肝葉分裝后液氮凍存，取材結束后移至-80℃冰箱保存。

1.5 肝臟指數計算

分別稱取大鼠肝臟質量和體質量，計算肝臟指數。肝臟指數（%）=肝臟質量（g）/大鼠體質量（g）×100%

1.6 肝臟病理評價

固定后的肝臟組織經脫水、透明、包埋、切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，光鏡下（200×）觀察肝臟病理變化。

1.7 蛋白質免疫組化分析

石蠟切片脫蠟后，經抗原修復、過氧化物酶阻斷、一抗及二抗孵育、二氨基聯苯胺顯色、細胞核復染，最后完成脫水封片。TLR4抗體由美國Santa Cruz公司提供，稀釋比為1∶50；p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38MAPK）抗體由美國Sigma公司提供，稀釋比分別為1∶100和1∶50；山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗由武漢Servicebio公司提供，稀釋比為1∶200。經全視野數字掃描整張組織切片，細胞核顏色為深棕色、棕黃色和淺黃色分判定為強陽性、中度陽性和弱陽性，細胞核藍色為陰性，依據陽性強弱關系計算組織化學評分（histochemistry score，Hscore）［7］用于組間分析。H-score=（弱陽性細胞密度×1）+（中度陽性細胞密度×2）+（強陽性細胞密度×3）。

1.8 其他指標測試方法

采用全自動生化分析儀檢測血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性。采用酶聯免疫吸附試驗測定肝臟腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）水平。相關試劑盒由北京華英生物技術研究所提供。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠體重和肝臟指數

與C組相比，M組體重顯著降低（P＜0.05）；與M組相比，LLM、MLM、HLM組均無統計學差異（P＞0.05）；不同劑量組組間無統計學差異（P＞0.05）。與C組相比，M組肝臟重量顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，LLM組無統計學差異（P＞0.05），MLM和HLM組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.05），其余組間無統計學差異（P＞0.05）。與C組相比，M組肝臟指數顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，LLM和MLM組無統計學差異（P＞0.05），HLM組顯著降低（P＜0.05）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.05），其余組間無統計學差異（P＞0.05，表1）。

Tab.1 Body weight and liver index in each group（±s，n=12）

Tab.1 Body weight and liver index in each group（±s，n=12）

C：Control group；M：Model group；LLM：Low-dose Lycium ruthenicum Murr.juice group；MLM：Medium-dose Lycium ruthenicum Murr.juice group；HLM：High-dose Lycium ruthenicum Murr.juice group *P＜0.05，**P＜0.01 vs group C；#P＜0.05，##P＜0.01 vs group M；△P＜0.05 vs group LLM

Group Body weight（g）Liver weight（g）Liver index（%）C 304.16±15.45 9.40±0.45 3.10±0.27 M 277.31±34.74*11.69±0.75**4.29±0.72**LLM 256.74±16.18 11.12±0.87 4.35±0.49 MLM 255.17±11.58 10.75±0.54#4.22±0.25 HLM 267.88±18.86 10.03±0.71##△3.75±0.33#△

2.2 各組大鼠肝臟損傷標志物活性

肝臟損傷標志物血清ALT活性，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，HLM組顯著降低（P＜0.05），其余兩組無統計學差異（P＞0.05）；不同劑量組組間無統計學差異（P＞0.05）。血清AST活性，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，LLM、MLM、HLM組均顯著降低（P＜0.01）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.05），其余組間無統計學差異（P＞0.05，表2）。

Tab.2 Indicators of liver injury in each group（U/L，±s，n=12）

Tab.2 Indicators of liver injury in each group（U/L，±s，n=12）

**P＜0.01 vs group C；#P＜0.05，##P＜0.01 vs group M；△P＜0.05 vs group LLM

Group ALT AST C 31.50±2.77 130.48±23.14 M 48.56±7.40** 233.23±39.98**LLM 44.16±9.34 181.12±16.59##MLM 40.00±9.06 161.97±28.16##HLM 35.28±7.88# 140.58±27.38##△

2.3 各組大鼠肝臟組織形態

200倍光鏡下觀察顯示（圖1），C組肝細胞排列規則，無變性、壞死及空泡化，肝小葉結構清晰，肝血竇無淤血，無炎性細胞浸潤。M組肝細胞間隙增大，出現空泡化，肝血竇擴張，血管周圍出現炎性細胞聚集，形成大量炎性小灶。LLM組無明顯改善，仍可見空泡化肝細胞和眾多炎性小灶。MLM組偶見肝細胞空泡化，肝血竇擴張情況有所緩解，可見炎性細胞聚集。HLM組肝小葉結構較完整，肝血竇無明顯擴張，僅少量炎性細胞浸潤。

Fig.1 Hepatic histopathological changes in each group（HE×200）

2.4 各組大鼠肝臟TLR4/p38 MAPK通路相關蛋白質水平

肝臟TLR4蛋白質表達，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，HLM組顯著降低（P＜0.01），其余兩組無統計學差異（P＞0.05）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.05），其余組間無統計學差異（P＞0.05）。p38 MAPK蛋白質表達，各組間均無統計學差異（P＞0.05）。p38 MAPK磷酸化水平，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，HLM組顯著降低（P＜0.05），其余兩組無統計學差異（P＞0.05）；不同劑量組組間無統計學差異（P＞0.05）。p-p38 MAPK/p38 MAPK結果，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，LLM組無統計學差異（P＞0.05），MLM和HLM組均顯著降低（P＜0.01）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.01），其余組間無統計學差異（P＞0.05，表3，圖2-4）。

Tab.3 H-score of hepatic TLR4/p38 MAPK signaling pathway-related proteins in each group（±s，n=12）

Tab.3 H-score of hepatic TLR4/p38 MAPK signaling pathway-related proteins in each group（±s，n=12）

**P＜0.01 vs group C；#P＜0.05，##P＜0.01 vs group M；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs group LLM

Group TLR4 p38 MAPK p-p38 MAPK p-p38 MAPK/p38 MAPK C 94.75±4.33 124.29±4.79 105.35±7.28 0.85±0.03 M 119.57±8.94** 129.09±7.96 133.06±12.01** 1.03±0.03**LLM 115.53±6.26 129.51±7.85 127.99±9.76 0.99±0.02 MLM 110.58±5.92 127.36±4.20 120.39±10.81 0.94±0.06##HLM 101.48±7.63##△ 127.25±6.98 113.80±6.22# 0.89±0.01##△△

Fig.2 Expression of hepatic TLR4 in each group（IHC-P×400）

Fig.3 Expression of hepatic p38 MAPK in each group（IHCP×400）

2.5 各組大鼠肝臟炎癥因子水平

Fig.4 Expression of hepatic p-p38 MAPK in each group（IHC-P×400）

肝臟TNF-α水平，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，HLM組顯著降低（P＜0.01），其余兩組無統計學差異（P＞0.05）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.05），其余組間無統計學差異（P＞0.05）。IL-1β水平，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，HLM組顯著降低（P＜0.05），其余兩組無統計學差異（P＞0.05）；不同劑量組組間無統計學差異（P＞0.05）。IL-10水平，與C組相比，M組顯著降低（P＜0.01）；與M組相比，LLM、MLM和HLM組均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；不同劑量組組間，MLM組顯著高于LLM組（P＜0.05），HLM組顯著高于LLM和MLM組（P＜0.05或P＜0.01）。IL-18水平，與C組相比，M組顯著升高（P＜0.01）；與M組相比，LML組無統計學差異（P＞0.05），MLM和HLM組均顯著降低（P＜0.01）；不同劑量組組間，HLM組顯著低于LLM組（P＜0.01），其余組間無統計學差異（P＞0.05，表4）。

3 討論

乙醇（酒精）是一種極性分子物質，可溶于水和脂質，攝入后通過胃腸道吸收進入血液循環，吸收后的酒精超過95%通過肝臟代謝，長期過量飲酒是造成肝臟疾病發生的主要原因，酒精性肝病已成為我國最主要的慢性肝臟疾病之一［1］。酒精及其代謝物可以直接或間接誘導炎癥反應、氧化應激以及蛋白質營養失衡等多種病理生理過程，這些因素相互作用，最終導致酒精性肝病的發生［2，8］。血清ALT和AST是評價肝臟功能的常用早期指標［1］。本研究中，模型組血清ALT和AST水平、肝臟指數較對照組顯著升高，且體重下降明顯，結合病理診斷，提示模型組大鼠出現酒精性肝臟損傷，模型建立成功。而黑果枸杞汁各劑量組與模型組相比，血清ALT和AST、肝臟指數及組織形態均出現不同程度改善，提示黑果枸杞汁能夠在一定程度上緩解酒精對大鼠肝臟結構和功能的損傷。這與同類型研究的結果基本一致［9，10］。

Tab.4 Hepatic inflammatory factors in each group（pg/mg，±s，n=12）

Tab.4 Hepatic inflammatory factors in each group（pg/mg，±s，n=12）

**P＜0.01 vs group C；#P＜0.05，##P＜0.01 vs group M；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs group LLM；▲P＜0.05 vs group MLM

Group TNF-α IL-1β IL-10 IL-18 C 6.18±0.09 2.78±0.17 2.68±0.14 8.39±0.29 M 6.81±0.33** 3.27±0.24** 1.51±0.21** 9.34±0.20**LLM 6.75±0.25 3.18±0.20 1.82±0.19# 9.06±0.19 MLM 6.56±0.31 3.04±0.29 2.14±0.15##△ 8.84±0.19##HLM 6.28±0.28##△ 2.92±0.24# 2.45±0.22##△△▲ 8.60±0.22##△△

TLR4屬于I型跨膜受體蛋白，酒精可以通過其代謝物乙醛直接上調TLR4通路信號轉導水平，也可通過損害腸道屏障功能，提高脂多糖水平，過量的脂多糖引起TLR4二聚化，經過一系列信號轉導途徑，最終激活下游信號蛋白，導致TNF-α、IL-1β和IL-18等多種炎性細胞因子的激活和分泌［11，12］。p38 MAPK能夠對多種應激刺激產生廣泛應答，是與炎癥反應有關的重要細胞內信號傳導途徑，與炎癥調節和控制機制密切相關，對于調節炎癥因子表達水平至關重要。蔣偉等［13］的研究表明，TLR4激活后，可以引起p-p38 MAPK表達增加。而慢性酒精攝入所致脂多糖增加，也可引起磷酸化p38 MAPK上調，穩定TNF-α的mRNA水平［14］。本研究中，模型組TLR4蛋白質表達和p38 MAPK磷酸化水平以及p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均顯著高于對照組，且TNF-α、IL-1β和IL-18水平顯著升高，表明酒精通過活化TLR4/p38 MAPK信號通路，引起肝臟炎癥水平升高。

研究表明，慢性酒精喂養不會導致TLR4基因缺陷小鼠肝臟中TNF-α和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）表達增加［15］。而通過抑制p38 MAPK表達，可以降低長期乙醇喂養大鼠枯否細胞中TNFα的表達［16］。IL-10作為一種抗炎因子，可以阻斷巨噬細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的產生［17］。上述炎癥信號途徑中的關鍵分子均可成為酒精性肝臟損傷的有效干預靶點。黑果枸杞含有花色苷、原花青素、多糖等多種活性成分。相關研究表明，黑果枸杞可降低血清中TNF-α和IL-6水平，對酒精性肝損傷發揮保護作用［9，10］。也可通過抑制腦組織中TLR4通路信號因子，下調TNF-α表達，上調IL-10表達［18］。本研究中，與模型組相比，黑果枸杞汁高劑量組肝臟TLR4蛋白質表達、p38 MAPK磷酸化水平、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值以及TNF-α、IL-1β和IL-18水平顯著降低，肝臟IL-10水平顯著升高，同時肝臟損傷標志物ALT、AST水平顯著下降，結合組織病理學變化，說明肝臟形態/功能明顯改善。黑果枸杞汁各劑量組間比較，高劑量組較低劑量組肝臟系數、血清AST、肝臟TLR4蛋白質表達、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值、TNF-α和IL-18水平均顯著降低，肝臟IL-10水平顯著升高；高劑量組較中劑量組肝臟IL-10水平顯著升高；中劑量組較低劑量組肝臟IL-10水平顯著升高。機制可能為：相對于干果，黑果枸杞汁在加工過程中營養成分損失較少，其富含的多種活性物質可通過抑制TLR4/p38 MAPK通路信號強度，改善促炎細胞因子和抗炎細胞因子間平衡關系，緩解酒精代謝引起的炎性損傷，發揮肝臟保護作用。

綜上，本研究成功建立酒精性肝損傷大鼠模型，黑果枸杞汁可通過介導TLR4/p38 MAPK信號通路，調節肝臟炎性因子水平，改善大鼠酒精性肝臟損傷，保護肝臟結構和功能正常，且高劑量組效果最優。