海馬齒狀回內beta腎上腺素能受體對睡眠剝奪大鼠空間學習記憶的作用及其機制*

呂 晶，王琮民△，劉 鑫，閆紀琳

（1.河北工程大學醫學院，2.河北工程大學附屬醫院，邯鄲 056038）

睡眠不良是日常生活中常見的現象，可導致嚴重的認知障礙，包括注意力下降、決策和記憶障礙［1-3］，海馬是腦內認知功能的重要區域。許多報道表明，睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）會導致海馬依賴的記憶障礙。例如，48 h SD可降低大鼠海馬依賴的空間學習記憶表現［3］。齒狀回區（dentate gyrus，DG）在學習記憶尤其是在空間編碼中發揮重要的功能［4］。長時程增強（long-term potentiation，LTP）是重要突觸可塑性細胞模型。研究發現，3～4 h的SD降低了DG顆粒細胞的LTP［5］，同時SD也可抑制顆粒細胞依賴的神經發生［6］。然而SD損害DG功能潛在的神經生物學機制尚不明確。

去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）是誘導和維持LTP所必需的重要神經遞質之一，廣泛分布于中樞神經系統。去甲腎上腺素能纖維主要起源于藍斑（locus coeruleus，LC），它們廣泛的投射到整個前腦區域，特別是海馬中［7］。更重要的是，研究發現在DG區去甲腎上腺素能投射最為密集，且beta-腎上腺素能受體（beta-adrenergic receptors，beta-AR）高度表達［7，8］。行為學研究表明，NE激活beta-AR是空間學習和記憶所必須，且DG中阻斷beta-AR不僅抑制空間學習還會損傷LTP的持久性［9，10］。然而，目前有關DG內beta-AR對SD大鼠空間學習記憶作用的研究報道較少。因此，本研究旨在研究beta-腎上腺素能信號對睡眠剝奪記憶障礙的干預作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試劑

清潔級雄性SD大鼠，體重250～300 g，由北京維通利華提供，許可證號：SCXK京2008-0011；剝奪桿式睡眠剝奪儀（上海新軟，XR-XS107）；腦立體定位儀（成都泰盟，DW-2000）；微量注射泵（日本Eicom，ESP-64）；石蠟切片機（金華華速科技，HS2046）；光學顯微鏡（萊卡，DMC5400）；異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO，I5627）購買自sigma；腦源性神經營 養 因 子（brain derived neurotrophic factor，BDNF，Ab108319）抗體購買自abcam。c-Fos（2250）及b-actin（3700）抗體購買自Cell signaling。

1.2 動物分組及模型制備

動物分為對照組，異丙腎上腺組（ISO），模型組（SD）和SD+ISO組。施加睡眠剝奪每日18 h，連續21 d，設備中的剝奪桿可以周期性地圍繞設備底部左右滑動，每次滑動時間30 s，速度3 m/min，間隔2 min，重復循環滑動。期間飲食飲水自由。對照組不進行處理。

1.3 微量注射針的植入及給藥

模型結束后，動物麻醉，穩定于儀器上，參照Pazinos和Watson大鼠腦圖譜［11］將外套管置于DG區上1.5 mm處（AP-3.4 mm；L/R-1.8 mm；H-2.5 mm），牙托水泥固定。術后休息3 d，將自制微量注射針（前端超出套管1.5 mm）植入套管內并固定。每日行為學檢測之前，應用微量注射泵將鹽水和ISO（2μg/μl溶于鹽水）通過注射管分別注射到ISO組，SD組和SD+ISO組DG區域，注射速度0.5μl/min，時間2 min，總體積1μl，滯留時間2 min。

1.4 大鼠行為學測試

Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）檢測空間學習能力。MWM分四個象限，圓形平臺放置在第III象限的中心。訓練包括定位航行（1～4 d）和空間探索（第5日）實驗。正式訓練前，動物先入水適應2 min。定位航行實驗中，大鼠每天分別從四個象限入水自由游泳，每次每只大鼠游泳時間限制120 s，若在此期間大鼠找到并爬上站臺穩定站立10 s，則大鼠進水至游上隱蔽平臺所逃逸時間記為逃避潛伏期，若120 s內未游上站臺，潛伏期為120 s?？臻g探索實驗中，將圓形平臺從游泳池中移除，記載2 min間動物在每個象限的時間比和穿臺次數。整個訓練中動物的游泳速度也將計入最終統計。

1.5 免疫組織化學染色

訓練結束大鼠處死，取出一側腦組織，經固定、濃度梯度遞減的乙醇溶液脫水、石蠟包埋、切為5μm的薄片、脫蠟、樣本處滴3%過氧化氫溶液，隨后微波熱源修護，燒杯內緩沖液沸騰后停止加熱，重復上述步驟3次。隨后組織切片自然冷卻，應用5%BSA封閉20 min，輕甩表面殘留液體。c-Fos一抗4℃過夜，第2日室溫下滴加二抗反應20 min，最后顯色，應用光學顯微鏡采集圖片。

1.6 免疫印跡

動物處死并在顯微鏡下分離一側DG組織。組織內加入RIPA裂解緩沖液，于冰上勻漿提取總蛋白，采用BSA蛋白定量試劑盒進行定量，提前配置濃縮和分離膠，SDS-PAGE凝膠電泳后轉PVDF膜，室溫下與5%脫脂牛奶孵育2 h，隨后PBST洗膜。分別加入含c-Fos（1∶1 000）和BDNF（1∶1 000）抗體4℃孵育過夜。洗滌后，應用二抗（1∶1 000）在室溫下孵育2 h。用化學發光試劑（ECL）顯影，凝膠成像系統采集圖片，應用image Lab軟件分析目的蛋白條帶和內參蛋白條帶的灰度值，將其二項蛋白條帶的灰度值比值作為蛋白相對表達量。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 海馬DG內beta-AR對大鼠空間學習與記憶功能的影響

2.1.1 海馬DG內beta-AR對大鼠空間學習能力的影響 前4日大鼠逃避潛伏期作為定位航行指標，代表大鼠的空間學習能力，結果如表1所示，各組大鼠前4 d逃逸時間伴隨學習天數累加均逐漸減少。與對照組相比，SD組在第2～4日逃逸時間明顯增加（P＜0.01）；ISO組在第4日逃避潛伏期顯著減少（P＜0.05），與ISO組相比，SD+ISO組第4日逃避潛伏期明顯增加（P＜0.05），然而與SD組相比，SD+ISO組逃逸時間降低，且在第3和4日具有顯著性差異（P＜0.01）。MWM水迷宮訓練中四組大鼠游泳速度均無顯著性差異（P＞0.05，表2）。

Tab.1 Comparison of escape latency in various groups of rats（s，±s，n=6）

Tab.1 Comparison of escape latency in various groups of rats（s，±s，n=6）

SD：Sleep deprivation；ISO：Isoproterenol *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs SD group；△P＜0.05 vs ISO group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs1 d

Group 1 d 2 d 3 d 4 d Control 52.27±17.34 29.93±12.52▲ 20.92±7.18▲▲ 18.61±6.45▲▲ISO 61.22±32.24 39.69±6.08 23.09±6.75▲ 10.35±4.07*▲▲SD 77.95±15.35 64.78±31.56** 58.44±19.74**▲ 38.95±18.11**▲▲SD+ISO 73.40±29.76 45.85±19.78 29.75±12.98##▲▲ 19.77±5.99##△▲▲

Tab.2 Comparison of swimming speed in various groups of rats（mm/s，±s，n=6）

Tab.2 Comparison of swimming speed in various groups of rats（mm/s，±s，n=6）

Group 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d Control 159.14±17.63 145.60±26.45 121.36±16.53 105.24±16.53 186.92±40.22 ISO 178.62±39.77 165.32±29.54 140.23±27.99 92.22±23.95 190.17±37.89 SD 143.87±18.29 134.40±8.54 143.67±14.32 125.90±28.36 190.79±8.69 SD+ISO 154.83±32.62 143.69±19.74 128.72±15.99 108.13±24.81 192.71±60.60

2.1.2 海馬DG內beta-AR對大鼠空間記憶能力的影響 第5日每個象限時間百分比及穿臺次數作為空間探索指標，代表大鼠的空間記憶能力，結果顯示，第5日所有組動物對第III象限均表現出顯著的偏愛，滯留時間最高（圖1）。如表3所示，與對照組相比，SD組III象限停留時間比例（P＜0.01）及穿臺次數（P＜0.05）均顯著降低。ISO組在目標象限停留時間百分比稍高，但無統計學意義（P＞0.05），穿臺次數兩組無顯著差異（P＞0.05）。與ISO組相比，ISO+SD組穿臺次數無明顯差異（P＞0.05），但III象限滯留時間均顯著減少（P＜0.05）。與SD組相比，ISO+SD組穿臺次數雖無顯著變化（P＞0.05），但III象限滯留時間顯著增加（P＜0.05）。四組間大鼠第5日游泳速度無顯著差異（P＞0.05，表2）。

Fig.1 Representative swimming traces in the spatial probe trial of MWM test

Tab.3 Comparison of the proportion of total time spent in each quadrant and number of platform crossing in various groups of rats（±s，n=6）

Tab.3 Comparison of the proportion of total time spent in each quadrant and number of platform crossing in various groups of rats（±s，n=6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs SD group；△P＜0.05 vs ISO group

Group Percentage of time spent in quadrant（%）（Quadrant）I II III（target） IV Number of platform crossing（Times/120 s）Control 18.83±5.92 18.12±6.85 43.57±7.98 19.48±6.36 8.67±3.01 ISO 11.86±8.15 15.96±3.21 49.81±2.96 20.95±6.63 8.16±4.28 SD 18.08±4.11 28.84±7.59* 31.33±3.20** 21.74±5.80 5.67±1.49*SD+ISO 18.01±4.06 17.94±8.59 40.00±5.90#△ 24.04±8.52 6.83±2.57

2.2 海馬DG內beta-AR對c-Fos蛋白表達的影響

圖2免疫組織化學結果顯示，DG區c-Fos蛋白在所有組別胞漿和核中均有所表達，其中在對照組，ISO組及SD+ISO組表達較明顯。免疫印跡結果顯示（表4，圖3），與對照組相比，SD組動物c-Fos表達明顯減少，ISO組大鼠c-Fos表達無顯著差異（P＞0.05）。SD+ISO組大鼠c-Fos蛋白水平較ISO組低（P＜0.05），但較SD組相比顯著增加（P＜0.05）。

Fig.2 The expressions of c-Fos detected by immunohistochemical staining（×20）

2.3 海馬DG內beta-AR對BDNF蛋白表達的影響

免疫印跡檢測DG區BDNF蛋白表達，結果如表4和圖3所示，與對照組相比，SD組DG區BDNF蛋白表達顯著下降（P＜0.05），與SD組相比，ISO+SD組中BDNF蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。對照組、SD+ISO及ISO組三組大鼠BDNF水平之間均無顯著差異（P＞0.05）。

Tab.4 Comparison of c-Fos and BDNF protein levels in the hippocampus DG in various groups of rats（±s，n=6）

Tab.4 Comparison of c-Fos and BDNF protein levels in the hippocampus DG in various groups of rats（±s，n=6）

*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs SD group；△P＜0.05 vs ISO group

Group c-Fos/b-actin BDNF/b-actin Control 0.725±0.174 0.726±0.881 ISO 0.867±0.240 0.612±0.306 SD 0.473±0.134* 0.392±0.102*SD+ISO 0.659±0.051#△ 0.540±0.129#

Fig.3 The expressions of c-Fos and BDNF detected by Western blot

3 討論

睡眠不足可對認知功能產生不利影響。多種研究都強調了SD會損害學習和記憶，特別是海馬依賴性記憶，如空間學習和記憶［1，12］。在本研究中也發現，SD大鼠在空間學習和記憶方面也表現出類似的損害。

海馬由不同的亞區組成，其中DG區對于編輯與分析空間位置記憶非常關鍵［4］。行為研究表明，LC激活后的NE釋放不僅能促進記憶的形成和鞏固，對于DG中LTP的誘導和維持也是必不可少的，而這些過程中主要由beta-AR所介導［9，10］。已知beta-ARs高表達于DG突觸后部位的顆粒細胞內［8］，且有研究發現，DG內特異性阻斷beta-AR會抑制LTP的產生而導致空間學習障礙［10］。因此，本研究探究在SD這一特殊情況下，DG內beta-AR對空間學習和記憶的影響。本研究在DG內微量注射beta-AR激動劑，結果顯示，外源性激活beta-AR可明顯改善SD誘發的空間學習與記憶障礙。早期研究發現，beta-AR激動劑增加DG顆粒細胞中電壓依賴性鈣通道的活性［13］。本研究室前期研究也發現，在海馬DG內ISO激活beta-AR后可增加突觸傳遞效率及DG區局部谷氨酸的水平，進而促進大鼠主動回避反應的獲得［11］，因此，本研究結果提示，beta-AR改善SD大鼠空間認知障礙可能與直接或間接影響DG區細胞興奮性進而調節突觸可塑性有關。

c-Fos作為即早基因一種，是目前最常用的神經元激活標志之一。很多研究表明，c-Fos在海馬中具有重要調節作用，調控神經元生長、發展及受損修復［14］。不僅如此，c-Fos還可調節長期記憶的形成及神經可塑性［15］，因此c-Fos表達常被作為神經可塑性的代表蛋白。在海馬DG區c-Fos高度表達，且可在海馬依賴性物體識別學習記憶后表達明顯增加［16］。然而，DG區beta-AR是否可調節c-Fos影響海馬學習記憶功能尚不明確。本研究結果顯示，c-Fos在海馬DG區大量表達，且SD降低DG區c-Fos蛋白水平，表明SD降低神經元活性。激活beta-AR后DG區c-Fos蛋白水平顯著增加，提示DG區beta-AR激活可調節c-Fos表達，增加神經元活性改善SD大鼠空間學習記憶表現。

BNDF作為廣泛研究的生長因子，在中樞神經系統中發揮許多關鍵功能。很多研究表明，BDNF在中樞內神經細胞再生、成熟以及突觸產生等過程發揮關鍵調控功能［17］。Mello-Carpes PB等人發現，NE激活beta-AR后，可通過增加海馬內BDNF表達提高海馬依賴性新物體認知記憶的鞏固［18］。因此，本實驗檢測了DG區突觸蛋白BDNF水平。結果顯示，SD會減少DG區BDNF水平，而ISO激活beta-AR后BDNF蛋白表達增加。研究發現，海馬內灌注BDNF會恢復應激誘發的空間記憶及LTP的損害［19］，而DG內NE作用beta-AR也可通過影響BDNF表達調節突觸可塑性參與到應激大鼠空間學習記憶中［9］。因此，本研究中海馬DG區beta-AR激活后改善SD大鼠空間學習記憶，可能是通過增加突觸蛋白BDNF相關突觸可塑性機制完成的，然而其具體生理機制還有待繼續探究。

綜上所述，本研究表明，海馬DG中beta-AR的激活通過增加c-Fos和BDNF蛋白的表達來改善SD誘發的空間學習和記憶障礙，本研究結果為改善SD誘發認知功能障礙相關研究提供理論基礎。