干燥綜合征合并特發性肺纖維化miRNA表達譜的變化及生物標志物的研究*

趙 珊，張 虹，梅 堅，畢丹艷

（云南省第一人民醫院 風濕免疫科，650032）

干燥綜合征（Sjogren/s syndrome，SS）是一種慢性和全身性自身免疫性疾病，以淋巴細胞浸潤和身體產生水分的外分泌腺（如淚腺和唾液腺）功能的喪失為其定義的表現。它是第二常見的風濕性自身免疫性疾病，影響0.5%～1%的普通人群［1］。淚腺和唾液外分泌腺的進行性炎癥與功能喪失有關，導致衰弱的干眼和干嘴。SS與包括腦、肺和肝在內的內臟器官炎癥增加有關，并使b細胞淋巴瘤的發病風險增加44倍［2］。SS可在沒有其他自身免疫性疾?。ㄔl性SS，PSS）的情況下發生，或伴有類風濕性關節炎，系統性紅斑狼瘡甚至可能導致特發性肺纖維化［3，4］。干燥綜合征合并特發性肺纖維化病情加劇，伴隨干咳，進行性呼吸困難，晚期常因心肺功能衰竭而死亡。有研究［5］對175例pSS患者進行職業暴露危險因素調查，觀察到接觸二氯甲烷、全氯乙烯、氯化溶劑、苯等芳香族溶劑與pSS發病明顯相關，提示職業暴露是pSS的危險因素。Barragan-Martinez［6］等人報道了三氯乙烯、苯和芳香族有機溶劑對免疫系統的影響，研究結果提示暴露在溶劑中會誘發氧化應激的增強，修飾參與上皮細胞凋亡的基因轉錄，這可能是干燥綜合征合并肺纖維化的一種病理分子機制。

目前，本病的發病機制沒有闡明，尚沒有針對性的藥物治療策略，臨床治療中以對癥治療和替代療法緩解病情為主。近年來隨著生物信息學的快速發展，結合芯片和高通量測序技術的不斷革新，為理解各類疾病發展的分子機制和病理基礎帶來了無限可能［7］。本研究擬通過芯片檢測分析干燥綜合征合并特發性肺纖維化患者血清中miRNA表達差異，發掘區別于原發性干燥綜合征的潛在生物標志物，在臨床中采取針對性診療策略。本課題經云南省第一人民醫院倫理委員會審核并批準，納入研究對象的患者均知曉并簽署知情同意書。

1 對象與方法

1.1 研究對象與分組

本研究將樣本分為干燥綜合征組與干燥綜合征合并肺纖維化組，本研究采用NCBI的基因表達綜合數據庫（GEO數據庫）獲得干燥綜合征及干燥綜合征合并肺纖維化的基因表達譜數據。干燥綜合征組3例，干燥綜合征合并肺纖維化患者3例，就診于云南省第一人民醫院。3例干燥綜合征患者為對照組，平均年齡為（55.67±4.78）歲，病程為（10.67±1.70）月；3例干燥綜合征合并特發性肺纖維化患者作為觀察組，平均年齡為（57.67±3.68）歲，病程為（11.00±2.45）月；6例患者均為女性。各組基本臨床資料差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 血清樣本的RNA提取與基因芯片檢測miRNA

Agilent Human miRNA Microarray Kit，Release 21.0，8×60K（DesignID：070156）芯片實驗以及6個樣本的數據分析在上海歐易生物醫學科技有限公司（上海，中國）進行。芯片上面包含了2 570個成熟的miRNA。

1.3 miRNA表達差異分析

采用基于二項分布的DESeq進行分析，從差異倍數和校正后的顯著水平（Padj/q值）兩個水平進行評估，以q值＜0.01、log2（差異倍數）＞1.5為篩選條件對差異miRNAs進行篩選。

1.4 qRT-PCR分析

根據說明書，總RNA反轉錄，得到cDNA作為模板，擴增目的基因及內參。用Prime Script TMRT反轉錄試劑盒和TB Green Premix Ex TaqTMⅡ定量試劑盒，進行miRNA表達水平驗證。反應條件：95℃5 min；95℃5 s，60℃20 s，95℃15 min，40個循環。采用2-ΔΔCt計算基因的表達水平，其中GAPDH作為內參。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 差異基因分析

利用R軟件分析血清樣本miRNA表達譜，共得到差異表達基因13個，包括上調基因6個和下調基因7個。繪制差異miRNA表達基因火山圖（圖1）。

Fig.1 Plot of differential miRNA volcanoes between two groups.Red dots indicate significantly up-regulated expression（log2-fold change＞1，P＜0.05）compared to miRNAs from two groups of serum samples，blue dots indicate significantly down-regulated expressed genes（log2-fold change＜-1，P＜0.05），and gray dots indicate nonsignificant differences.The vertical coordinate represents the adjusted P-value（Padj），the smaller the adjusted Pvalue，the more significant the difference and the larger the corresponding-log10（Padj）value.Thus，the dots in the upper left and upper right corners indicate down-regulated and up-regulated genes，respectively，with highly significant differences

2.2 靶基因預測

分別選取上調最明顯的6個miRNA：hsa-miR-6740-5p，hsa-miR-4507，hsa-miR-6775-5p，hsa-miR-4281，hsa-miR-4459，hsa-miR-6089和下調的7個miRNA：hsa-miR-6873-3p，hsamiR-4290，hsa-miR-6858-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-92b-3p，hsa-miR-3151-3p，hsa-miR-6886-3p，使用miRDB和miRWalk在線預測工具，對差異miRNA進行潛在的靶基因預測分析，交互得到363個下游靶基因（圖2）。

Fig.2 Possible target genes of differential miRNAs screened by two online prediction tools，miRWalk and miRDB

2.3 KEGG和GO富集分析

GO分析：在生物過程方面，主要富集與細胞代謝過程、細胞生長過程的調節、上皮細胞增殖等過程。在細胞組成方面主要富集于細胞質膜、染色質、受體復合物等細胞成分中［8］。分子功能方面主要富集與轉錄輔助因子活性、氨基多糖結合、染色質結合、細胞粘附分子結合等分子功能。KEGG分析顯示主要集中于PI3K、AKT信號通路、癌癥中的轉錄失調、乙型肝炎等信號通路。結果顯示wnt信號通路差異明顯，是特發性肺纖維化的關鍵信號通路（圖3，4）。

Fig.3 GO enrichment analysis

Fig.4 KEGG enrichment analysis

2.4 qRT-PCR驗證表達有差異的miRNA在血清中的表達水平

根據差異倍數，我們選擇差異最明顯的前五個miRNA進行驗證。結果如表1所示，miRNA在兩組血清樣品中的表達趨勢與芯片檢測所得表達趨勢一致，且與干燥綜合征組比較，干燥綜合征合并肺纖維化組血清中miR-6886-3p，miR-6873-3p，miR-574-3p表達水平明顯下調，差異顯著，具有統計學意義。相反的，miR-6740-5p和miR-4507在干燥綜合征合并肺纖維化組中表達上調，差異明顯（P＜0.05）。

Tab.1 The relative expressions of miRNA in the serum were detected by RT-qPCR analysis（±s，n=3）

Tab.1 The relative expressions of miRNA in the serum were detected by RT-qPCR analysis（±s，n=3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs desiccation syndrome（PSS）

Group PSS PSS+IPF miR-6886-3p 1.472±0.867 0.088±0.100*miR-6873-3p 0.950±0.551 0.080±0.053*miR-574-3p 3.269±1.037 0.229±0.045**miR-6740-5p 1.889±0.878 9.861±6.284*miR-4507 1.122±1.174 5.702±3.349*

3 討論

干燥綜合征是一種自身免疫性疾病，而非口干。眼干的單一性疾病。目前，診斷及用藥治療策略尚缺少循證醫學證據佐證，臨床中更多地為經驗性用藥［9，10］。miRNA可以與下游靶基因結合，競爭性抑制靶基因的表達。通常一個miRNA可以調控多個靶基因，而一個靶基因可能受到多個miRNA的調控，共同組成調控網絡［11］。我們從多靶點，多通路的研究角度出發，深入探究干燥綜合征及特發性肺纖維化的發病機制及其潛在的治療靶點，探討特異性miRNA在診斷干燥綜合征及特發性肺纖維化中的具有重要意義。

miRNA芯片檢測技術具有高通量［12-14］，靈敏性好，樣本需求低等特點。目前也應用于多種復雜疾病的診斷與新藥研發。本研究借助miRNA芯片，成功篩選出干燥綜合征合并特發性肺纖維化疾病相關的13個差異miRNA。和干燥綜合征比較，合并特發性肺纖維化患者血清中hsa-miR-6740-5p，hsa-miR-4507，hsa-miR-6775-5p，hsa-miR-4281，hsa-miR-4459，hsa-miR-6089表 達 上 調，hsa-miR-6873-3p，hsa-miR-4290，hsa-miR-6858-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-92b-3p，hsamiR-3151-3p，hsa-miR-6886-3p表達下調。此外，對miRNA的靶基因進行KEGG富集分析，結果提示Wnt信號通路和細胞衰老的相關信號通路的調控與肺纖維化有密切關系。有報道稱Wnt信號通路是通過細胞表面受體將信號從細胞外傳遞到細胞內發揮調控作用［15，16］。因此Wnt信號通路已經成為抑制纖維化的潛在靶點。有研究發現［17］Lrp5缺失小鼠影響Wnt/β-catenin信號通路，減弱博來霉素誘導的肺纖維化。李［18］等發現CGRP可以抑制eIF3a上調p27的表達，抑制肺成纖維細胞從而抑制肺纖維化的發展。Tao等［19］也發現沉默FZD7可抑制TGF-β1誘導的肺纖維化，并且能夠通過Wnt信號通路進行信號轉導參與組織纖維化的調節。此外，田［20］等證實益氣化瘀化痰方可以通過下調TGF-β1，調控的TGFβ/Snail信號軸，減緩博來霉素誘導的肺纖維化損傷。我們芯片檢測結果證實了Wnt信號通路涉及的分子可能是干燥綜合癥合并特發性肺纖維化的關鍵標志物，這對于特發性肺纖維化的診斷及潛在的新藥研發具有指導意義。此外，有報道證實有機溶劑與自身免疫性疾病有關，如系統性紅斑狼瘡、系統性硬化癥，類風濕關節炎和干燥綜合征等［21］。干燥綜合征作為一種自身免疫性疾病，職業暴露尤其是苯等芳香族有機溶劑，有加劇職工免疫系統紊亂的風險，誘發自身免疫功能失衡，因此關鍵生物標志物的發現對臨床早期診斷和治療職業暴露誘發的肺纖維化具有重大意義。

綜上所述，本研究利用基因芯片研究干燥綜合征合并特發性肺纖維化的差異表達miRNAs及下游信號通路。研究發現干燥綜合征合并特發性肺纖維化患者血清中存在13個差異miRNA，wnt信號通路在特發性纖維化病理過程中發揮關鍵作用，這些差異miRNAs和wnt信號通路相關蛋白均可能是特發性纖維化臨床診斷和新藥研發的標志物，其為肺纖維化治療策略提供了理論支持，也為治療肺纖維化相關的職業病提供指導性意見。在治療肺纖維化等職業病的新藥研發中，高度特異miRNAs也可能成為新的藥物靶點，也為我們后續深入研究職業暴露誘發干燥綜合征合并肺纖維化確定了研究方向。