超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白特性的影響

師希雄，王建忠，陳敬敬，張珍，郭兆斌，余群力

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

藏羊屬于我國典型的草地型藏系綿羊，主要分布于四川、青海、甘肅等省的高原地區，能在海拔3 000 m 以上缺氧的環境中生存[1]。甘南藏羊可分為歐拉，甘加和喬科3種類型。其中，歐拉羊的數量和產肉量最多。歐拉藏羊肉具有高蛋白、低脂肪、無污染、富含礦物質和氨基酸等特點，是一種優質的天然綠色有機食品[2]。蛋白質是羊肉的主要組成部分，包括肌原纖維蛋白、肌漿蛋白和基質蛋白。其中，肌原纖維蛋白約占總蛋白含量的50%～55%[3-4]。此外，肌原纖維蛋白是具有生物學功能的鹽溶性結構蛋白，它們的生化特性與肉制品的乳化、流變、凝膠、組織特性和風味有關，在肉制品的加工過程中起到非常重要的作用[5]，但是由于肌原纖維蛋白的分子質量較大，結構較復雜，肽鏈展開不足，與水接觸面積小，降低了溶解度，在一定程度上制約了乳化性、起泡性等其他功能特性，限制了其應用。因此，改善藏羊肉肌原纖維蛋白的特性至關重要。

蛋白質的改性可通過超高壓、超聲波、熱處理、凍融等方式實現。其中，超高壓是一種新型的非加熱加工技術，能起到滅菌、鈍化酶活性及改變蛋白質結構的作用[6-7]。肌原纖維蛋白被超高壓處理后，其生化性質(乳化、發泡、膠凝等)可以通過分子間疏水作用、氫鍵、二硫鍵等化學作用得到改善[8-9]。目前，有關超高壓對肌原纖維蛋白特性的影響已有報道。BRAVO等[10]研究發現，脫脂牛乳超離心上清液蛋白經超高壓處理后，其溶解度隨壓力強度的增大呈先上升后下降的趨勢，且在250 MPa時取得最大值。MARCOS 等[11]發現牛肉肌原纖維蛋白經超高壓處理后溶解度隨壓力的增大呈現先上升后下降的趨勢，且在200 MPa時溶解度達到最大。涂宗財等[12]研究發現,超高壓處理能提高大豆分離蛋白的起泡性。XUE等[9]研究發現超高壓處理能夠改善雞肉肌原纖維蛋白的溶解度。邱春江[13]研究發現鰱魚經超高壓處理后，提高了鰱魚肌原纖維蛋白的表面疏水性。近年來，超高壓技術已被用于牛肉、豆類、水產品等肌原纖維蛋白性的改性，但其對歐拉藏羊肉肌原纖維蛋白特性的影響尚未見報道。

因此，本研究以歐拉藏羊肉肌原纖維蛋白為實驗對象，對其進行不同壓力強度(0、150、250、350、450、550 MPa，保壓10 min)處理后，測定肌原纖維蛋白的乳化性、起泡性、溶解度、濁度、巰基和羰基含量，探究超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白特性的影響，以便為藏羊肉肌原纖維蛋白的改性和超高壓技術的運用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機選取自然放牧、健康狀況良好、體重相近[(50±5) kg]的4～5歲甘南歐拉藏羊3只，采用伊斯蘭教屠宰法屠宰放血后，迅速取其后腿肉，剔去結締組織和表面筋膜等后，切成約10 g左右的小塊，液氮冷凍運回實驗室，并在-80 ℃冷凍貯藏，以備后期提取肌原纖維蛋白并測定相關指標。

NaCl、KCl、NaOH、NaKC4H4O6、CuSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)等均為分析純,北京索萊寶科技有限公司；金龍魚大豆油，蘭州北京華聯超市。

1.2 儀器與設備

CQC2L-600超高壓設備，北京速原中天股份有限公司；TG16G型高速冷凍離心機，江蘇東華分析儀器有限公司；752 N紫外-可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；WB100-4F恒溫水浴鍋，瓊安電氣科技有限公司；380B型真空包裝機，安盛科技有限公司等。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考PARK等[14]的方法并略作修改。稱取2 g肉樣于離心管中，然后加入8 mL標準鹽溶液(10 mmol/L 磷酸鉀緩沖液，0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，pH 7.0)，13 000 r/min 勻漿10 s，然后在4 ℃條件下離心( 3 000×g，20 min)，倒掉上清液后，沉淀繼續用8 mL標準鹽溶液溶解，隨后在4 ℃條件下以3 000×g的轉速離心20 min，棄上清；沉淀用8 mL 0.1 mol/L NaCl溶液以上述條件洗滌2次，0.1 mol/L NaCl溶液溶解沉淀后，經組織搗碎機振蕩均勻，用單層紗布過濾去除殘留筋膜，然后用0.1 mol/L HCl調節pH為6.0，最后離心(4 ℃，3 000×g，20 min)，棄去上清液，所得沉淀為肌原纖維蛋白。

1.3.2 超高壓處理肌原纖維蛋白

在聚乙烯袋中裝入稀釋好的肌原纖維蛋白溶液20 mL，用真空機進行封口。先打開恒溫槽預熱，待溫度達到(23±2) ℃時將樣品放入加壓艙內，設置處理壓力分別為：0、150、250、350、450、550 MPa，保壓10 min，高壓介質為水。其中0 MPa樣品不做任何處理。超高壓處理后立即冰水浴冷卻后測定相關指標，如不能及時測定置于4 ℃環境中貯存，并于48 h內使用。

1.3.3 乳化特性的測定

參考張維農等[15]方法并略作修改。首先用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)將肌原纖維蛋白溶液調至5 mg/mL，然后吸取9 mL與3.0 mL大豆油混合，9 500 r/min均質1 min后，快速從乳濁液底部吸取20 μL，然后將其用1 g/L 十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)調到5 mL，使其充分混合，然后于500 nm處測吸光值A0，并在10 min后再次從底部吸取20 μL并用1 g/L SDS稀釋至5 mL，測其吸光值A10，空白對照為1 g/L SDS。

(1)

(2)

式中：T為常數，2.303；A0和A10為均質后乳濁液的吸光值；F為乳狀液中油的體積分數25%；t為反應時間，10 min；C為蛋白質質量濃度,g/mL。

1.3.4 溶解度的測定

參考BENJAKUL等[16]方法并略作修改。首先將肌原纖維蛋白溶液用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)稀釋至2.5 mg/mL，吸取5 mL樣品溶液于塑料離心管中，振蕩使其充分溶解后，將其放置于4 ℃冰箱中1 h，取出后在4 ℃條件離心20 min(4 500 r/min)，測定其離心前后上清液中蛋白質含量，按公式(3)計算：

(3)

1.3.5 起泡性的測定

參考張維農等[15]方法并略作修改。首先將肌原纖維蛋白溶液用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)稀釋至10 mg/mL，然后取5 mL樣品溶液于玻璃量筒中，加入10 mL蒸餾水后體積記為V，均質2 min(10 000 r/min)后快速記錄體積V0，放置30 min后，再次記錄體積為V30。計算如公式(4)和公式(5)所示：

(4)

(5)

1.3.6 表面疏水性測定

參考CHELH等[17]方法并略作修改，肌原纖維蛋白溶液用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)稀釋至2 mg/mL，取2 mL于離心管中，然后向離心管中加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(pH 6.0)，使其混合均勻。用2 mL磷酸緩沖液(20 mmol/L，pH 6.0)替換上述的樣品溶液作為對照組。樣品和對照組室溫下振蕩10 min，離心(7 000 r/min，15 min)，取1 mL稀釋10倍，在波長為595 nm處測定OD值。計算如公式(6)所示：

(6)

式中：A對照和A處理分別為對照組和處理組的OD值。

1.3.7 羰基含量的測定

參考LIU等[18]方法并略作修改。

1.3.8 巰基含量的測定

參考LIU等[18]方法并略作修改。

總巰基的測定：用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)將肌原纖維蛋白溶液稀釋至1 mg/mL，取0.5 mL與4.5 mL緩沖液中(8 mol/L尿素，0.01 mol/L EDTA，0.1 mol/L KH2PO4，pH 6.0)混合在離心管中，然后再加入100 μL Ellman試劑[0.01 mol/L (2-硝基苯甲酸)，0.01 mol/L KH2PO4，pH 6.0]，振蕩30 s，充分混合，靜置25 min，最后在412 nm處測其吸光值，消光系數為13 600 L/(mol·cm)。

活性巰基的測定：除緩沖液中沒有尿素外，其他方法和總巰基一樣。計算如公式(7)所示：

(7)

式中：ρ為蛋白質量濃度,mg/mL;A表示樣品OD值;73.53為常數。

1.3.9 濁度的測定

參照BENJAKUL等[19]方法略作修改。首先將肌原纖維蛋白溶液用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)稀釋為1 mg/mL，然后取5 mL于離心管中，在45 ℃水浴保持30 min，隨后冷卻到室溫，其吸光度在波長為600 nm處測定。

1.4 數據處理

實驗均進行3次重復。SPSS 22.0軟件被用于統計分析來驗證顯著性差異，所有數值均通過單因素差異分析(ANOVA)結合Duncan′s多重范圍檢驗進行評估，其中P<0.05被視為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響

如圖1所示，隨著超高壓處理強度的增加，肌原纖維蛋白的羰基含量顯著上升(P<0.05)，150～250 MPa范圍內羰基含量變化沒有顯著性差異，在550 MPa時，比對照組高54.8%。由此可見，超高壓處理引起了肌原纖維蛋白氧化程度的增加。

圖1 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.1 The effect of ultra-high pressure treatment on the carbonyl content of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基的影響

如圖2所示，當壓力強度增加時，顯著降低了肌原纖維蛋白總巰基含量(P<0.05)，而活性巰基含顯著上升(P<0.05)，在550 MPa時，總巰基含量比對照組低30.3%，活性巰基含量比對照組高56.7%。超高壓處理能使肌原纖維蛋白總巰基含量降低，活性巰基含量增加。

圖2 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的影響Fig.2 The effect of ultra-high pressure treatment on the total sulfhydryl and active sulfhydryl of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

2.3 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

如圖3所示，在壓力強度不高于350 MPa時，表面疏水性隨著壓力強度的增加顯著上升(P<0.05)，且350 MPa時取得最大值94.9 μg，比對照組高39.8%，350～550 MPa沒有顯著性差異(P>0.05)。因此，超高壓處理提高了肌原纖維蛋白的表面疏水性。

圖3 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.3 The effect of ultra-high pressure treatment on the surface hydrophobicity of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

2.4 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白溶解度的影響

如圖4所示，在壓力強度不高于350 MPa時，溶解度隨壓力強度的增加顯著上升(P<0.05)，并且在350 MPa時取得最大值93.3%，比對照組高54.8%(P<0.05)，壓力強度高于350 MPa時，溶解度隨壓力強度的增加呈降低的趨勢，且450～550 MPa溶解度差異不顯著(P>0.05)。超高壓強度處理能提高肌原纖維蛋白的溶解度。

圖4 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig.4 The effect of ultra high-pressure treatment on the solubility of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

2.5 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白濁度的影響

如圖5所示，在150～350 MPa范圍內，隨著超高壓強度的增加藏羊肉肌原纖維蛋白的濁度顯著下降(P<0.05)，且在450 MPa時取得最小值0.60，比對照組低20%，350 MPa以后差異不顯著(P>0.05)，由此可見，超高壓處理可以降低肌原纖維蛋白的濁度。

圖5 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白濁度的影響Fig.5 The effect of ultra-high pressure treatment on the turbidity of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

2.6 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白起泡性及起泡穩定性的影響

如圖6所示，在0～250 MPa，起泡性顯著上升(P<0.05)，在350～450 MPa差異不顯著(P>0.05)，550 MPa時起泡性顯著降低；在0～350 MPa，起泡穩定性隨著壓力強度的增加顯著上升(P<0.05)，且在350 MPa 時獲得最大值75%，比對照組高26.7%(P<0.05)，450～550 MPa沒有顯著性差異(P>0.05)。說明，超高壓處理改善了肌原纖維蛋白的起泡性能。

圖6 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白起泡性及起泡穩定性的影響Fig.6 The effect of ultra-high pressure treatment on the foamability and foaming stability of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

2.7 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

如圖7所示，藏羊肉肌原纖維蛋白的乳化性隨壓力強度的增加呈現先增加后下降的趨勢(P<0.05)，并且在 350 MPa 時達到最大值 76.3 m2/g，比對照組高56.6%，在壓力強度不高于250 MPa時，隨著壓力強度的增加，肌原纖維蛋白的乳化穩定性增強，在250 MPa時取得最大值，并且比對照組高13.1%。超高壓處理改善了肌原纖維蛋白的乳化性能。

圖7 超高壓處理對藏羊肉肌原纖維蛋白乳化性及乳化穩定性的影響Fig.7 The effect of ultra-high pressure treatment on the emulsifying activity and emulsifying stability of myofibrillar protein from Tibetan sheep meat

3 討論

羰基反映蛋白質的氧化程度，羰基含量越高，說明蛋白質的結構變化越大[20]。巰基是蛋白質中最具有反應活性的功能基團，蛋白質的穩定性與巰基的含量有關[5]。本研究發現，肌原纖維蛋白經超高壓處理后，其活性巰基和羰基含量顯著增加，而總巰基含量顯著降低。原因可能是肌原纖維蛋白經超高壓處理后，其分子結構展開，包埋在內部的巰基基團暴露其表面，增加了活性巰基含量，并且暴露在蛋白表面的一些巰基與氧氣結合形成了二硫鍵，降低了總巰基含量；而羰基含量增加的原因是蛋白經超高壓處理后結構發生變化，引起各種氧化酶產生活性氧和非氧自由基[21]。郭麗萍[21]研究發現超高壓處理使豬肉肌漿蛋白的羰基含量升高。李長樂[22]研究發現鰹魚肌原纖維蛋白總巰基含量在100～500 MPa時表現出下降，而活性巰基含量升高。本研究結果與上述報道一致。

表面疏水性能反映蛋白質結構的變化情況，蛋白質中的非極性氨基酸和疏水基團與表面疏水性具有一定的相關性[5]。本研究發現，在壓力強度不高于350 MPa時，表面疏水性隨著壓力強度的增加呈顯著性上升，高于350 MPa后，表面疏水性降低?？赡茉蚴?50 MPa以下的壓力改變了蛋白質分子的空間結構，暴露了一些疏水性氨基酸殘基，從而導致表面疏水性增加。但當壓力強度超過350 MPa后蛋白質結構展開，更多的氨基酸暴露出來并且重新開始分布，使得部分疏水性下降。本研究結果與邱春江[13]報道的研究結果相一致。

溶解度是反映蛋白質功能性質的重要指標。本研究發現，隨超高壓強度的增強，肌原纖維蛋白的溶解度呈先上升后下降?？赡苁怯捎趬毫Φ陀?50 MPa時蛋白質經適度變性后與水分子的結合能力增強，造成溶解度升高，而過大的壓力強度會使蛋白質空間結構遭到破壞，疏水基團暴露并聚集形成不溶性聚集體，從而降低了溶解度[11]。本試驗結果與MARCOS等[11]關于牛肉肌原纖維蛋白溶解度在0.1～400 MPa范圍內隨壓力增大呈先上升后下降趨勢的報道相一致。BRAVO等[10]發現超高壓處理乳清蛋白也有類似的現象。溶解度是由電荷頻率和表面疏水性所決定，當電荷頻率越高、表面疏水性越低時，肌原纖維蛋白的溶解度越高，反之則越小。本研究結果表明溶解度隨表面疏水性的增加而變大，這可能是由于電荷頻率對肌原纖維蛋白溶解度的影響遠遠大于表面疏水性的作用。

濁度是反映蛋白質顆粒大小的指標。本研究發現，肌原纖維蛋白的濁度隨壓力強度的增大呈先下降后略微升高趨勢。結果與WU等[4]報道的研究結果相一致，其研究發現牡蠣肌原纖維蛋白濁度在0～120 MPa時表現出顯著下降。其原因可能是在超高壓的作用下，一些大的聚集體逐漸解體，使蛋白質顆粒變小，導致濁度降低。因蛋白質顆粒變小，暴露出更多的表面積，增加了水分子與蛋白質的結合能力，從而導致溶解度升高，這與上述溶解度增加的結果一致。

反映蛋白質功能性質的重要指標包括起泡性和乳化性，一般情況下蛋白質分子越小，起泡能力越弱[23]。乳化性是指蛋白質能使油水結合形成穩定乳化液的能力[24]。乳化穩定性是指在水油不分離情況下蛋白質能保持乳濁液的能力[25]。本研究發現，藏羊肉肌原纖維蛋白的起泡性和乳化性隨著壓力強度的增大呈先上升后降低。MARCOS等[11]報道的牛血清蛋白的起泡性能隨著壓力強度的增加先升高后降低。李長樂[22]研究發現鰹魚肌原纖維蛋白被壓力處理后，提高了肌原纖維蛋白的乳化性能。本研究結果與上述報道一致?？赡茉蚴禽^低的壓力使得蛋白質結構發生適度解離，使內部疏水基團暴露出，導致乳濁液水油界面的張力減小，增加了分子柔性，有助于起泡性能和乳化性能增強。之后，隨著壓力的進一步增大蛋白質的結構被破壞，導致暴露出的疏水基團再次聚合增加了乳濁液中不溶性物質的含量，削弱了乳化性能和起泡性能[22]。

4 結論

超高壓(150～550 MPa)處理藏羊肉肌原纖維蛋白后，其乳化性、乳化穩定性、溶解度、起泡性、起泡穩定性及表面疏水性隨著壓力的增大呈先上升后下降的趨勢，壓力強度為350 MPa時，乳化性、溶解度、起泡穩定性和表面疏水性達到最大值，濁度呈先下降后保持穩定，壓力強度為450 MPa時，達到最小值。另外，羰基含量和活性巰基含量顯著上升，總巰基含量顯著下降?？傊?，適宜的壓力條件可以顯著改善藏羊肉肌原纖維蛋白的功能特性，并且防止氧化，從而為肉制品開發奠定基礎。