葛根-枳椇子藥對發酵工藝及解酒功效評價研究

倪以宇，趙大慶，倪偉鋒，曾婧，白竹林，王思明

(長春中醫藥大學,吉林省人參科學研究院，吉林 長春，130117)

葛根(PuerariaelobataeRadix)是豆科植物野葛的干燥塊根，枳椇子為鼠李科枳椇屬植物枳椇(HoveniaacerbaLindl.)的肉質果柄和干燥成熟的種子?；谖墨I記載[1-5]，大都認為黃酮類化合物是解酒保肝的主要活性成分，而葛根、枳椇子中均含有豐富的黃酮類化合物，如葛根素、大豆苷元、二氫楊梅素和槲皮素等活性成分[1-2]，其中從葛根、枳椇子中提取的黃酮化合物可以通過抑制體內對乙醇的吸收加速代謝以降低體內血醇濃度并增加體內抗氧化能力，從而達到解酒保肝的作用[2-3]。葛根、枳椇子等為藥食同源的傳統解酒毒藥物[4]，也是在臨床應用、保健品、普通食品等方面最常采用的藥物組合之一[5-6]。早在四千余年前，中國就利用微生物發酵進行釀酒、制醬醋，在此基礎上加入中藥材，形成了最早形式的中藥發酵工藝[7]。結合目前研究進展，通過微生物發酵確實能對部分藥材起到減毒增效[8-9]的作用。

本文以葛根-枳椇子為原料，采用課題組前期所優選最適的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)這2種可用于普通食品的菌種，探究植物乳桿菌和副干酪乳桿菌混合發酵對提升葛根和枳椇子解酒功效的影響，確定發酵工藝。開發出因發酵而達到“增效”的高活性、高解酒能力的解酒護肝的功效型產品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

葛根，安國市安興中藥飲片有限公司(經長春中醫藥大學中藥鑒定教研室王哲副教授鑒定為來源于豆科植物野葛的干燥塊根)；枳椇子，河北仁心藥業有限公司(經長春中醫藥大學中藥鑒定教研室王哲副教授鑒定為來源于鼠李科枳椇屬植物枳椇的成熟種子)；MRS肉湯培養基，北京索萊寶科技有限公司；56°紅星二鍋頭，北京紅星股份有限公司；葛根五味子片，廣東現代漢方科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純)；植物乳桿菌(Lac-tobacillusplantarum)：CGMCC1.568、副干酪乳桿菌(Lac-tobacillusparacasei)：CGMCC1.2468，中國普通微生物菌種保藏管理中心；天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷氨酸-丙酮酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒，上海優選生物科技有限公司。

1.1.2 實驗動物

SPF級ICR小鼠，雄性，4周齡，個體質量(20±2) g，購自長春億斯實驗動物技術有限公司(許可證號：SCXK(吉)-2020-0002)。飼養環境溫度為(23±2) ℃，相對濕度為40%～60%，光照、黑暗各12 h。

1.2 儀器與設備

SX-700蒸汽滅菌器，日本TomyDigitalBiology公司；KQ-600E超聲清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；ZQPW-70全溫振蕩培養箱，天津萊玻特瑞儀器設備有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津公司；Infinite 200 Pro酶標儀，瑞士TECAN公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葛根-枳椇子發酵工藝流程

基于課題組前期試驗篩選，采用固體發酵的方式[7],工藝流程如下：

葛根-枳椇子→粉碎過80目篩網→混合放入100 mL錐形瓶中→分別加入40 mL(料液比1∶4)MRS培養基→(121 ℃，20 min)滅菌→冷卻至室溫

1.3.2 發酵菌液制備

取液氮中甘油凍藏的植物乳桿菌和副干酪乳桿菌，解凍后接種至MRS肉湯培養基中進行活化[1%(體積分數)總接種量、37 ℃、200 r/min]，活化2遍，活化完成。根據單因素和正交試驗所需要的不同發酵條件接種到葛根-枳椇子中發酵(37 ℃、200 r/min)[10]。

1.3.3 提取方式篩選

使用水提、醇提這兩種常規提取方法，基于《太平惠民和劑局方》記載，葛根-枳椇子常用質量比為1∶1。水提:葛根-枳椇子加水煎煮1 h，3 500 r/min離心10 min后過絹布去藥渣，加95%(體積分數)食用乙醇至提取液中，配制成含40%(體積分數)乙醇的溶液，醇沉12 h后過絹布去渣滓[11-13]，揮醇濃縮為0.15 g/mL(生藥濃度)的濃縮液；醇提:葛根-枳椇子加入6倍于生藥量的60%(體積分數)乙醇，水浴80 ℃，回流提取1 h，后過絹布去渣滓，80 ℃揮醇，濃縮為0.21 g/mL(生藥濃度)的濃縮液。通過解酒防醉實驗來比較不同提取方式對解酒防醉效果的影響[14]。

1.3.4 單因素試驗

起始條件是pH值6.5、接種比例(體積比)(植∶副)=1∶1、總接種量5%(質量分數)、發酵時間72 h，進行單因素試驗，考察不同起始條件pH值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)，接種比例(體積比)(植∶副)(1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1)、總接種量(2%、3%、4%、5%、6%、8%)(質量分數)，發酵時間(24、36、48、60、72、84 h)對黃酮含量和醉酒醒酒時間的影響。

1.3.5 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以pH值(A)、總接種量(B)、發酵時間(C)、接種比例(植∶副)(D)為試驗因素，以黃酮含量(R)和醉醒酒時間(S)為評價指標，運用L9(34)正交設計試驗配合多指標綜合加權評分法，優選出最佳的發酵工藝，方差分析因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.6 解酒防醉實驗

取SPF級ICR雄性小鼠若干只，適應性飼養7 d后，按照單因素試驗條件隨機分為模型組、不發酵提取液組、空白發酵組(不加藥材只加菌)、發酵提取液組(不同起始條件的發酵提取液)，禁食不禁水12 h后，給藥組分別灌胃相應藥物(0.075 mL/10g)，模型組灌胃等劑量純水。30 min后，每組各灌胃56°白酒(0.125 mL/10g)，分別觀察并記錄每組小鼠醉酒潛伏期(灌酒-翻正反射消失的時間)和醒酒時間(翻正反射消失-翻正反射恢復的時間)[14-15]。

1.3.7 生物指標檢測

1.3.7.1 預處理

取適應性飼養7 d后SPF級ICR雄性小鼠70只，隨機分為空白組、模型組、陽性對照組(葛根五味子片)、葛根-枳椇子不發酵組、葛根-枳椇子發酵組(低、中、高劑量)，空白組和模型組純水(0.15 mL/10g)灌胃，其他給藥組給予相應藥物灌胃陽性組(5 mg/10g)、不發酵組(15 mg/10g)、葛根-枳椇子發酵提取液低劑量組(7.6 mg/10g)、葛根-枳椇子發酵提取液中劑量組(15 mg/10g)、葛根-枳椇子發酵提取液高劑量組(23 mg/10g)，30 min后，除空白組灌胃純水外，其他組均灌胃56°酒(0.08 mL/10g)，連續8 d[16-18]。灌酒30 min后取血，脊椎脫臼法處死小鼠，解剖取肝臟，在預冷的培養皿中，用生理鹽水洗凈后，清除水分，錫紙包裹，凍入液氮[19]。

1.3.7.2 小鼠血清指標檢測

末次給藥后，摘眼球取血，4 ℃靜置30 min，4 ℃離心(3 000 r/min、10 min)，取上清液得血清，參照試劑盒說明書測定7組小鼠血清中ALT、AST、IL-6、TNF-α等指標。

1.3.7.3 肝臟勻漿指標檢測

稱取0.1 g肝臟組織，加入9倍體積的生理鹽水，在預冷的研缽中充分研磨制成勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液得10%組織勻漿，參照試劑盒說明書測定7組小鼠肝臟中SOD水平。

1.4 實驗數據統計與處理

每組實驗重復3次，實驗數據均用平均值±標準差(Mean±SE)表示；采用GraphPad Prism 8.0.1進行誤差分析和差異顯著性分析以及繪圖；用IBM SPSS Statistics 21.0設計正交試驗以及方差分析。

2 結果與分析

2.1 提取方法比較

由圖1可知，使用醇提取的藥液延長醉酒潛伏時間的效果優于水提取的藥液，并且使用醇提取的藥液縮短翻正反射恢復時間的效果也優于水提取的藥液。推測原因可能是大部分黃酮類化合物相對于水而言，用有機溶劑更容易提取出來。因此，試驗最佳的提取方法是醇提。

a-解酒潛伏時間；b-翻正反射恢復時間圖1 不同提取方法對解酒防醉時間的影響Fig.1 Effect of different extraction methods on anti drunkenness time

2.2 單因素試驗

2.2.1 起始pH和總接種量對黃酮含量的影響

由圖2可知，隨起始pH值和總接種量升高黃酮含量先升高后降低，在pH為6.5時黃酮含量最高。原因可能是，強酸弱酸都會抑制乳酸菌的生長代謝；而總接種量達到3%(質量分數)之后黃酮含量與總接種量呈反比例關系，推測原因可能是菌密度過大，乳酸菌的繁殖代謝等活動受到生長空間等因素的影響而衰減。

a-pH值；b-總接種量圖2 pH值和總接種量對黃酮含量的影響Fig.2 Effects of pH value and total inoculation amount on favonoids content

2.2.2 發酵時間和接種比例對黃酮含量的影響

由圖3可知，黃酮含量在48 h時最高，在過了峰值48 h之后與發酵時間呈負相關，原因可能是在48 h 前乳酸菌處于生長期，過了48 h生長過盛，導致營養物質供不應求，使黃酮含量降低；當兩種菌株接種比例過高或者過低時，黃酮含量都比較低，接種比例(體積比)(植∶副)=1∶2時，黃酮含量最高。

a-發酵時間;b-接種比例圖3 發酵時間和接種比例對黃酮含量的影響Fig.3 Effects of fermentation time and inoculation ratio on flavonoids content

2.2.3 起始pH對醉酒醒酒時間的影響

由表2可知，延長醉酒潛伏時間的效果隨起始pH的升高呈先升高再降低的趨勢，在pH為6.5時達到峰值；縮短翻正反射恢復時間的效果隨起始pH值的升高呈先降低再升高的趨勢，在pH為4.5時達到峰值。

表2 pH值對醉酒醒酒時間的影響Table 2 Effect of pH value on sobering time

2.2.4 乳酸菌總接種量對醉酒醒酒時間的影響

由表3可知，延長醉酒潛伏時間的效果在總接種量在3%之前逐漸上升，在6%達到峰值，隨后呈下降趨勢；縮短翻正反射恢復時間的效果隨總接種量的升高呈降低的趨勢，在總接種量為2%時達到峰值。

表3 總接種量對醉酒醒酒時間的影響Table 3 Effect of total inoculum volume on drunken waking time

2.2.5 發酵時間對醉酒醒酒時間的影響

由表4可知，延長醉酒潛伏時間的效果在48 h達到峰值；縮短翻正反射恢復時間的效果與發酵時間呈反比例關系，在發酵時間為36 h時達到峰值。

表4 發酵時間對醉酒醒酒時間的影響Table 4 Effect of fermentation time on drunkenness and sobering time

2.2.6 接種比例對醉酒醒酒時間的影響

接種比例對延長醉酒潛伏時間的影響如表5所示，結果表明，植物乳桿菌與副干酪乳桿菌比例在2∶1時效果最好，乳桿菌(植∶副)接種比例=1∶1時，縮短翻正反射恢復時間的效果最好。

表5 接種比例對醉酒醒酒時間的影響Table 5 Effect of inoculation proportion on drunkenness and sobering time

2.3 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以起始pH值(A)、總接種量(B)、發酵時間(C)、接種比例(植∶副)(D)為評價因素，根據因素影響發酵工藝效果的重要程度分配權重系數。即黃酮含量(W1)的權重系數為0.7，醉酒潛伏期(W2)的權重系數為0.15，醒酒時間(W3)的權重系數率為0.15進行加權求和，綜合加權評價結果見表6和表7[20]。

表6 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for optimization of fermentation conditions

表7 正交試驗結果方差分析Table 7 Analysis of variance of orthogonal test results

根據正交試驗結果極差分析，發酵工藝影響黃酮含量的主次因素為C(發酵時間)>A(pH值)>B(總接種量)>D(接種比例)，以黃酮含量為主要指標發酵條件的最佳組合是A3B1C1D3。即最佳發酵工藝為pH 7，總接種量2%，接種比例(植:副)2∶1，發酵時間36 h。方差分析結果顯示，A、B和C因素起始pH值、總接種量和發酵時間顯著(P<0.05)影響黃酮含量，D因素接種比例對黃酮含量影響不顯著(P>0.05)。

2.4 驗證試驗

最佳條件下，進行平行試驗3次，黃酮含量依次為3.627、3.698、3.760 mg/g，平均值為3.70 mg/g，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)1.8%(RSD<5%)，較發酵前提升了33%，故此發酵工藝設計合理。

2.5 血清指標檢測

如圖4所示，根據給藥8 d后小鼠血清中轉氨酶水平的檢測，與空白組相比，連續灌胃酒精8 d后的模型組的小鼠血清中ALT、AST活性極顯著升高,IL-6、TNF-α含量顯著和極顯著升高(P<0.05和P<0.01)，表明酒精性肝損傷造模成功；與模型組相比，灌胃陽性藥和葛根-枳椇子高劑量發酵提取液的小鼠血清AST活性極顯著降低(P<0.01)；灌胃陽性藥、葛根-枳椇子低、中、高劑量發酵提取液的小鼠血清ALT活性極顯著降低(P<0.01)；灌胃不發酵提取液和葛根-枳椇子低、中、高劑量發酵提取液的小鼠血清IL-6含量極顯著降低(P<0.01)；灌胃陽性藥、不發酵提取液、葛根-枳椇子低、中、高劑量發酵提取液的小鼠血清TNF-α含量極顯著降低(P<0.01)，表明葛根-枳椇子發酵提取液能減輕酒精對肝臟的損傷，其中葛根-枳椇子發酵提取液效果均優于不發酵組，且高劑量組效果最優。

a-AST；b-ALT；c-IL-6；d-TNF-α圖4 小鼠血清AST、ALT活性檢測及IL-6、TNF-α含量檢測結果Fig.4 Detection of serum AST and ALT activities and IL-6 and TNF-α in mice Content test results注：#P<0.05表示與空白組比較，具有顯著性差異，##P<0.01表明與空白組比較，具有極顯著性差異；*P<0.05表示與模型組比較，具有顯著性差異，**P<0.01表明與模型組比較，具有極顯著性差異(下同)

2.6 肝臟SOD活力檢測

如圖5所示，根據給藥8 d后小鼠肝臟的抗氧化酶水平的檢測，與空白組相比，連續酒精灌胃8 d后的模型組的小鼠肝臟SOD活性極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，灌胃陽性藥和葛根-枳椇子低、中、高劑量發酵提取液的小鼠肝臟SOD活性顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)，其中葛根-枳椇子發酵提取液效果均優于不發酵組，且高劑量組效果最優。

圖5 小鼠肝臟SOD活力檢測結果Fig.5 Detection results of SOD activity in mouse liver

3 結果與討論

本實驗首次運用兩種可用于普通食品的乳酸菌(植物乳桿菌、副干酪乳桿菌)混合發酵葛根-枳椇子，考察其發酵前后黃酮含量變化的同時還運用多指標加權評分法對小鼠耐酒醒酒時間的變化進行分析，使其可行性更高。由優化發酵工藝條件的正交試驗結果得，葛根-枳椇子的最佳發酵工藝條件為pH 7，總接種量2%(質量分數)，接種比例(體積比)(植∶副)2∶1，發酵時間36 h。與發酵前比較，黃酮含量提升了33%；與模型組比較，發酵前后的醉酒潛伏時間分別延長了64.7%和51.7%，發酵前后的翻正反射恢復時間提前了29.2%和37.1%，減輕了肝損傷引起的小鼠血清中AST、ALT、IL-6和TNF-α水平升高，同時提升了小鼠肝臟的SOD活力。結果表明，與發酵前相比，兩種菌混合發酵后的藥物確實顯著提高了解酒護肝的功效(P<0.05)?？梢?，葛根-枳椇子的混合發酵可以提升藥物中黃酮類化合物的含量，加強解酒能力，極大程度的改善由酒精導致的肝損傷?；谖墨I大都認可黃酮是解酒保肝的主要活性成分，因此我們主要對黃酮類化合物的成分變化來進行研究，其成分分析也是我們下一階段將進行的研究。