超聲-ε-聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理對鮮切蘋果的保鮮作用

張玉華，孟 一，朱金峰，孫 毅，孫崇德

（1.國家農產品現代物流工程技術研究中心，山東濟南 250103；2.山東商業職業技術學院山東省農產品貯運保鮮技術重點實驗室，山東濟南 250103；3.浙江大學園藝產品冷鏈物流工藝與裝備國家地方聯合工程實驗室，浙江杭州 310058）

新鮮果蔬經切分后汁液流出，為微生物的繁殖提供營養，同時切割使組織裸露增加了微生物的侵染機會，致使其品質下降，貨架期縮短，并且可能引起食源性疾病，對公眾健康構成風險。因此如何抑制微生物的生長，是延長鮮切果蔬貨架期，保證其食用安全性的關鍵。清洗處理是控制微生物滋生的有效手段，超聲波用于鮮切果蔬的清洗殺菌，是利用低頻高能量超聲波的空化效應在液體中產生瞬間高溫高壓和強大的沖擊波，導致微生物細胞壁、細胞膜和DNA遭到破壞，從而達到殺滅微生物的目的。超聲波因其環保、無殘留、安全和簡便高效等性能被廣泛用于果蔬貯藏保鮮，已在鮮切黃瓜、生菜和百合鱗片、胡蘿卜、紅薯、白菜、蓮藕等鮮切果蔬的微生物控制方面取得良好的效果。超聲波是一種輔助殺菌方法，將其與化學或生物殺菌劑結合，殺菌效果更好。針對不同鮮切果蔬原料的特點，選擇合適的復合清洗技術和清洗條件十分必要。

-聚賴氨酸鹽酸鹽是一種天然生物抑菌劑，具有安全性高、熱穩定性強以及抑菌譜廣等優點，已被美國、日本、韓國和中國批準使用，對微生物具有廣譜的抗菌性包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌等，已研究用于鮮切蘋果、馬鈴薯、茄子、菠菜保鮮。將超聲波與-聚賴氨酸鹽酸鹽結合用于鮮切蘋果清洗處理的研究尚未見報道。

本研究將一定濃度的-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液作為清洗液，與超聲波結合用于處理鮮切蘋果，以貯藏期內菌落增長數為響應值，通過響應面法對超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理條件進行優化。利用優化條件處理的鮮切蘋果在4 ℃貯藏期間，根據其菌落總數、霉菌和酵母、色差和V的變化，系統分析超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理對鮮切蘋果的保鮮作用，以期為鮮切蘋果清洗技術研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富士蘋果 購于山東省煙臺市，于0～1 ℃下預冷，選取大小、成熟度一致，無腐爛、擠壓傷和病蟲害的蘋果備用；-聚賴氨酸鹽酸鹽 上海原葉生物科技有限公司；2,6-二氯靛酚鈉、草酸、碳酸氫鈉 國藥集團化學試劑有限公司；保鮮膜為厚度為0.1 mm PE膜；保鮮盒為PP 材料。

F-060SD 超聲波清洗器 深圳福洋科技集團有限公司；CR-400 色差計 杭州柯盛行儀器有限公司；Scientz-04z 均質器 寧波新芝生物科技股份有限公司；DL-CJ-2N 型超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；YXQ-LS-30S11 高壓滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 切分前超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理：新鮮蘋果→挑選→沖洗→超聲（超聲頻率40 kHz，功率480 W）--聚賴氨酸鹽酸鹽室溫下清洗→去皮、切分（四等分切塊）→2.0 g/L L-半胱氨酸護色液浸泡5 min→瀝干→放入保鮮盒中，保鮮膜封口→4 ℃貯藏。

切分后超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理：新鮮蘋果→挑選→沖洗→去皮、切分（四等分切塊）→超聲（超聲頻率40 kHz，功率480 W）--聚賴氨酸鹽酸鹽室溫下清洗→2.0 g/L L-半胱氨酸護色液浸泡5 min→瀝干→放入保鮮盒中，保鮮膜封口→4 ℃貯藏。

超聲時間的選擇：在20 ℃下，分別超聲5、10、15、20、25 min，-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度為0.3 g/L。

超聲溫度的選擇：分別在20、25、30、40、50 ℃下，超聲10 min，-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度為0.3 g/L。

-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度的選擇：分別利用0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 g/L-聚賴氨酸鹽酸鹽，在20 ℃下超聲10 min。

1.2.3 響應面優化試驗設計 在單因素實驗基礎上，進一步采用Box-Behnken 模型設計試驗，以超聲溫度（A）、超聲時間（B）和-聚賴氨酸鹽酸鹽濃（C）三個影響因素為自變量，以4 ℃貯藏期間第12 d 與第0 d 相比增加的菌落總數為響應值Y（其中切分前處理對應的菌落增長數為Y，切分后處理對應的菌落增長數為Y）。Box-Behnken 試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素與水平Table 1 Box-Behnken experimental factors and levels

1.2.4 超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理鮮切蘋果貯藏試驗 利用響應面優化的超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理方法，分別于切分前、切分后處理蘋果，以未處理組為對照。將鮮切果蔬置于保鮮盒內，用保鮮膜封口，于4 ℃下貯藏，每2 d 取樣分別檢測菌落總數、霉菌和酵母、色差和V含量。

1.2.5 鮮切蘋果品質指標的測定

1.2.5.1 菌落總數的測定 參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》規定的方法測定。取10 g 樣品，置于無菌均質袋中，加入90 mL 無菌水，用拍打式均質器拍打1～2 min，制成1:10 樣品勻液。再進一步稀釋，選擇3 個適宜稀釋度的樣品勻液，取1.0 mL 稀釋液于滅菌凝固的培養基中，將菌懸液涂布均勻，每個稀釋度做3 個平行，36±1 ℃培養24 h 后計數。

1.2.5.2 霉菌和酵母的測定 參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》中霉菌和酵母的平板計數法測定。操作方法同菌落總數測定，采用馬鈴薯葡萄糖培養基，28±1 ℃培養48 h 后計數。

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1.2.5.3 色差的測定 按照Zhang 等的方法測定，色差的變化由、、值的變化來表示，3 個參數分別表示亮暗程度、紅色度、黃色度。最終色差值由總色差△來表示，以標志白板進行色差計調零。記錄、、值，并計算△值，△=[（△）+（△）+（△）]

1.2.5.4 V的測定 參照GB 5009.86—2016《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》中2,6-二氯靛酚滴定法測定。

1.3 數據處理

采用Design-ExpertV8.0.6 進行響應面結果分析，采用OriginPro8.5 軟件繪圖，采用SPSS Statistics 20.0 軟件對數據進行統計學分析，采用Duncan 多重比較法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲時間對鮮切蘋果微生物的影響 以各實驗組第12 d 與第0 d 相比增加的菌落總數、霉菌和酵母數量為縱坐標，超聲時間為橫坐標繪圖，分別見圖1、圖2。隨超聲時間延長，菌落總數、霉菌和酵母數量增加值呈先低后高的變化趨勢，超聲10 min 組最低，超聲25 min 組最高，說明超聲時間并非越長越好，長時間超聲處理對蘋果的組織結構產生機械性破壞，使其更容易染菌。切分后超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理組貯藏期間菌落總數、霉菌和酵母增加值高于對應的切分前處理組，可能是由于去皮、切分后蘋果組織與外界環境接觸，微生物侵染幾率增加。最佳超聲時間的考察范圍為5～15 min。

圖1 超聲時間對菌落總數增長的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the growth of the total number of colonies

圖2 超聲時間對霉菌和酵母數量增長的影響Fig.2 The effect of ultrasound time on the growth of mold and yeast populations

2.1.2 超聲溫度對鮮切蘋果微生物的影響 超聲波的殺菌效果與介質溫度有關，一般來說溫度越高，殺菌效果越好，但高溫易破壞鮮切果蔬品質。由圖3、圖4 可見，鮮切蘋果菌落總數、霉菌和酵母的增加值均隨超聲溫度升高而降低，40 ℃與50 ℃兩組無顯著差異（＞0.05）。與超聲時間對微生物增長的影響相似，切分前超聲處理組菌落總數、霉菌和酵母增加值低于對應的切分后超聲處理組。因此，選擇30、40和50 ℃作為因素水平進行響應面優化試驗。

圖3 超聲溫度對菌落總數增長的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the growth of the total number of colonies

圖4 超聲溫度對霉菌和酵母數量增長的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the growth of mold and yeast populations

2.1.3-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度對鮮切蘋果微生物的影響 不同濃度-聚賴氨酸鹽酸鹽對鮮切蘋果4 ℃貯藏0～12 d 期間菌落總數、霉菌和酵母數量增長的影響分別見圖5、圖6。將-聚賴氨酸鹽酸鹽作為超聲液使用，其濃度越高抑菌效果越好，當濃度增加至0.2 g/L 時，進一步增加，即0.3 g/L 與0.4 g/L 兩組差異不顯著（＞0.05）。這與范凱研究結果類似，范凱研究了超聲波與-聚賴氨酸聯合氣調對鮮切生菜冷藏期間品質的影響，發現隨著-聚賴氨酸濃度增加，抑制微生物效果增加，當-聚賴氨酸濃度從0.4增至0.5 g/L 時，-聚賴氨酸對鮮切生菜貯藏過程中菌落總數、霉菌與酵母菌數量無顯著性差異。因此，選擇0.1、0.2 和0.3 g/L 作為響應面試驗的三個水平。

圖5 ε-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度對菌落總數增長的影響Fig.5 Effect of ε-polylysine hydrochloride concentration on the growth of the total number of colonies

圖6 ε-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度對霉菌和酵母數量增長的影響Fig.6 Effect of ε-polylysine hydrochloride concentration on the growth of mold and yeast populations

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果 采用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗結果（表2）進行回歸分析，并進行二項式擬合和多元線性回歸法處理，得到切分前、切分后超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理鮮切蘋果各考察因素的一次效應、二次效應及其交互效應的實際因素關聯方程分別如下：

表2 Box-Behnken 試驗結果Table 2 Results of Box-Behnken experiment

2.2.2 回歸方程方差分析 為驗證方程的有效性，對上述回歸方程進行方差分析，結果見表3、表4。切分前、后超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理兩個模型均極顯著（＜0.01），失擬項不顯著（＞0.05），表明兩模型均具有較高可靠性。調整決定系數分別為0.9637、0.9798，表明鮮切蘋果菌落總數的變化源于超聲時間、超聲溫度和-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度的可能性分別為96.37%、97.98%。根據一次項的值，可知各試驗因素對響應值菌落總數增長的影響的主次順序為：C＞A＞B，即-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度＞超聲時間＞超聲溫度。其中，切分前超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理組一次項A 和C 對結果影響顯著（＜0.05）；切分后超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理組一次項A 和C 對結果影響為極顯著（＜0.01），超聲溫度對結果均無顯著影響（＞0.05）。交互項中AB 項對結果影響不顯著（＞0.05），AC 和BC 項對結果影響顯著（＜0.05），表明A、B 無交互作用，A、C 和B、C 間有交互作用；二次項A、B和C對結果影響極顯著（＜0.01）。綜上說明，試驗設計是可靠的，并且可以用來預測各種因素對菌落總數增長的影響。

表3 切分前超聲-ε-聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理組回歸模型的方差分析Table 3 The variance analysis of regression model of ultrasonicε-polylysine hydrochloride compound treatment group before cutting

表4 切分后超聲-ε-聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理組回歸模型的方差分析Table 4 The variance analysis of regression model of ultrasonicε-polylysine hydrochloride compound treatment group after cutting

2.2.3 響應面分析 圖7 為超聲時間、超聲溫度和-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度各因素交互作用對鮮切蘋果菌落總數增長影響的響應面3D 圖。在固定其它因素的情況下，隨著所考察因素值的升高，菌落總數均降低，在響應曲面的最低點（等高線的中心點）達到最小值后，菌落總數又呈現上升趨勢。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用較強，圓形表示交互作用較弱。圖中a、a的等高線接近圓形，b、b、c、c的等高線均為橢圓形，說明A、B 間交互作用不顯著，A、C 與B、C 間交互作用顯著，與方差分析結果一致。

圖7 超聲時間、超聲溫度和ε-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度的交互作用對菌落總數增長影響的響應面3D 圖Fig.7 Response surface 3D diagram of the interaction of ultrasound time,ultrasound temperature and ε-polylysine hydrochloride concentration on the growth of the total number of colonies

2.2.4 驗證試驗 根據Design-Expert8.0.6 軟件分析和數據優化，得到切分前超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理最優條件為超聲時間為9.56 min、超聲溫度為40.63 ℃、-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度為0.21 g/L，方程預測值為1.53 lg CFU/g。切分后超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理最優條件為超聲時間為9.55 min、超聲溫度為40.63 ℃、-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度為0.21 g/L，方程預測值為1.62 lg CFU/g。根據實際可操作性，將切分前與切分后超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理條件修正為超聲時間為10 min、超聲溫度為40 ℃、-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度為0.2 g/L。利用該優化參數處理鮮切蘋果，在4 ℃下貯藏，切分前、后超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理組第12 d 比0 d 增加的菌落總數實際測定平均值分別為1.59 lg CFU/g、1.71 lg CFU/g，預測值與實測值相對誤差分別為3.92%、5.59%，誤差較小，說明響應面法建立的兩個模型是可靠的。

2.3 超聲-ε-聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理對鮮切蘋果貯藏品質的影響

2.3.1 超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理對鮮切蘋果貯藏期間微生物的影響 利用響應面優化的參數處理鮮切蘋果，在4 ℃貯藏過程中，菌落總數、霉菌和酵母數量變化情況如圖8、圖9 所示。對照組微生物數量增長速度最快，至第8 d 時，菌落總數4.48 lg CFU/g、霉菌和酵母3.95 lg CFU/g，結合感官分析判斷接近貨架期終點，超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理組上升速度顯著低于對照（＜0.05），其中切分前處理組第12 d 時接近貨架期終點，切分后處理組第10 d 時基本無食用價值。因此，從微生物角度判斷，切分前超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理鮮切蘋果可延長貨架期4 d，切分后處理可延長貨架期2 d。

圖8 鮮切蘋果貯藏期間菌落總數變化Fig.8 Changes of total colony number of fresh-cut apples during storage

圖9 鮮切蘋果貯藏期間霉菌和酵母變化Fig.9 Mold and yeast changes of fresh-cut apples during storage

2.3.2 超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理對鮮切蘋果貯藏期間色差的影響 近年來，超聲波在果蔬防褐變研究中得到了較好的應用。研究證明，在適當的條件下，超聲處理能延緩鮮切果蔬的酶促褐變，原因是通過超聲波空化作用、熱效應和機械作用抑制與果蔬褐變相關的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）等的活性。賈玉等利用超聲波輔助異抗壞血酸處理鮮切蘋果，處理組的△值、PPO 活性及POD 活性均低于對照組。Fan 等研究發現，超聲波聯合-聚賴氨酸處理降低了鮮切萵苣的失重和總色差，降低了POD和PPO 活性?！鞅硎究偵?，其值越小，褐變程度越低。鮮切蘋果在4 ℃貯藏過程中，△變化如圖10所示，呈上升趨勢。其中，切分前超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理組色差上升速度顯著最慢（＜0.05），對照組與切分后超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理組無顯著差異（＞0.05），可能是由于超聲時間過長或強度過高造成切分后的蘋果組織結構破壞，細胞膜通透性增加，導致酚類物質與酚類氧化酶接觸，加速褐變。

圖10 鮮切蘋果貯藏期間色差值的變化Fig.10 Color difference changes of fresh-cut apples during storage

2.3.3 超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理對鮮切蘋果貯藏期間V含量的影響 經超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理的鮮切蘋果在4 ℃貯藏期間V含量變化如圖11 所示，隨貯藏時間延長，各處理組V含量逐步下降，貯藏12 d 內，切分前、切分后超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理組與對照組V含量下降值分別為27.42%、29.03%和29.92%，均無顯著差異（＞0.05），說明超聲處理產生的空化作用、熱效應和機械作用并未對鮮切蘋果的V產生破壞作用。

圖11 鮮切蘋果貯藏期間VC 含量的變化Fig.11 VC content changes of fresh-cut apples during storage

3 結論

采用Box-Behnken 設計響應面法分別建立了蘋果切分前、切分后超聲時間、超聲溫度、-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度與0～12 d 內菌落增長數之間的響應面數學模型，確定了超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理鮮切蘋果的最佳工藝參數為超聲時間10 min、超聲溫度40 ℃、-聚賴氨酸鹽酸鹽濃度0.2 g/L，切分前與切分后處理菌落總數增加的實測值分別為1.59 lg CFU/g、1.71 lg CFU/g，與預測值相對誤差分別為3.92%、5.59%，表明采用Box-Behnken 法優化鮮切蘋果超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理方法可行、可靠。在此最優條件下處理的蘋果4 ℃貯藏期間，細菌、霉菌和酵母在一定程度上受到抑制，褐變減緩，且該處理方式對鮮切蘋果的V無明顯破壞作用，其中切分前超聲--聚賴氨酸鹽酸鹽復合處理對鮮切蘋果保鮮效果較好，其貨架期比對照組延長4 d。本研究為鮮切蘋果清洗技術提供了一定的理論依據，對促進鮮切果蔬產業發展具有重要意義。