利用轉移法和間接法建立兒童肌酐水平參考區間的比較

孟 濤，陳 劍，杜佳琳，逄 璐，李海霞，許 冬

北京大學第一醫院檢驗科，北京 100034

參考區間是指健康個體中95%測量值的分布范圍[1]，是疾病診斷與健康狀況評估的標準。由于地域分布、種族、性別、年齡、生活習慣以及檢測方法等多方面的差異，實驗室應該建立適合所服務人群的參考區間，或者對已有的參考區間進行驗證。美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)和國際臨床化學聯合會(IFCC)發布的指南EP28-A3c中[2]，推薦建立本實驗室的參考區間，但大多數實驗室很難完成該項工作，因此建議通過以下兩種方法來實現：(1)實驗室收集20個健康個體的樣本來驗證參考區間，該參考區間的建立是用更嚴格的標準建立的；(2)可以通過CLSI-EP09文件來轉移驗證參考區間，但前提條件是測定結果有可比性，分析結果高度相關。目前我國成年人慢性腎臟病(CKD)的患病率為10.8%，兒童CKD患病率為(14.9～118.9)/100萬,不同研究之間存在較大差異，且多項研究發現,隨著年齡增大該病發病率逐漸升高[3]。由于兒童肌酐參考區間明顯不同于成人，因此建立適合不同性別和年齡組的兒童肌酐參考區間在兒童CKD的診斷和治療中有重要意義。目前檢測肌酐常用的方法主要有堿性苦味酸法和肌氨酸氧化酶法(簡稱苦味酸法和酶法)，研究顯示這兩種方法間存在一定的差異[4]。本文研究目的在于通過檢測一定數量的標本，建立酶法和苦味酸法檢測肌酐水平的相關性，從而利用轉移法將《兒童臨床常用生化檢驗項目參考區間：WS/T 780-2021》(以下簡稱為WS/T 780-2021)推薦的兒童肌酐參考區間進行轉移，建立苦味酸法檢測兒童肌酐水平的參考區間，同時利用醫院LIS大數據以及Hoffmann方法間接建立本地區兒童肌酐水平的參考區間，進一步用間接法建立的參考區間來驗證轉移后參考區間的適用性，評估兩種方法參考區間的差異[5-7]。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1轉移法標本的收集 收集2022年1月就診于本院的CKD患兒的新鮮剩余血清，要求標本無溶血、黃疸、脂血，肌酐水平小于150 μmol/L，共收集305份血清標本，分別采用WS/T 780-2021[8]推薦的酶法和苦味酸法對肌酐水平進行檢測。

1.1.2間接法數據的處理 利用醫院LIS選取2018年1月至2021年12月本院收治的18歲以下89 916例兒童肌酐水平的檢測結果，剔除標準：(1)非兒科門診患者；(2)存在脂血、溶血、黃疸等的異常標本；(3)蛋白尿、血尿及其他腎臟病患者；(4)無性別、姓名、年齡的患者；(5)國籍為非中國籍患者；(6)標本種類為非血清的患者；(7)同一患者多次檢測肌酐時，第1次檢測結果后的其他結果；(8)年齡<28 d或>18歲的患者。最終經篩選后獲得24 450例兒童肌酐水平檢測結果。

1.2儀器及試劑 酶法：羅氏Cobas702，配套酶法肌酐檢測試劑(批號577466)、羅氏生化多項校準品(批號499017)?？辔端岱ǎ贺惪寺鼛鞝柼谹U5800，配套苦味酸法肌酐檢測試劑(批號2634)、貝克曼生化多項校準品(批號11220)。質控品為朗道HUMAN ASSAYEDMULTI-SERA(批號1285UN、1006UE)。質控規則采用Westgard多規則(12s、13s、22s和R4s)進行室內質量控制，累計變異系數(CV)均在設定的范圍之內，室間質評均合格。

1.3方法

1.3.1轉移法建立參考區間 將收集的305份新鮮血清分別用酶法和苦味酸法對肌酐水平進行檢測，將所得數據進行比對分析，剔除明顯偏倚數據，剩余292份有效數據采用最小二乘法進行回歸分析，得到酶法與苦味酸法檢測肌酐水平的回歸方程，將其代入WS/T 780-2021推薦的兒童肌酐參考區間[8]，從而得到轉換后的兒童肌酐水平參考區間。

1.3.2間接法建立參考區間 采用SPSS19.0軟件中的 Kolmogorov-Smirnov檢驗對24 450例兒童肌酐數據進行分層并進行正態性分析，對非正態分布數據利用BLOM公式進行正態轉換，將轉換后數據采用Tukey法[9]計算25%和75%的百分位數的值(P25，P75)及四分位間距(IQR)(P75～P25)，剔除(P25-1.5×IQR)～(P75+1.5×IQR)以外的數據，再將篩選后的數據重復按照Tukey法進行離群值篩選，直至所有數據均落在上、下臨界值內為止。剔除后的正態分布的數據，利用Hoffmann法將取得的數據線段上2.5%和97.5%作為該項目的參考區間。

1.3.3參考區間驗證 參考變化值(RCV)是利用室內質控變異數據，結合健康者和患者體內生物學變異數據計算得出，利用公式RCV=21/2×Z×(CVa2+CVi2)1/2計算得到肌酐的RCV[10]，收集2018-2021年內兩個水平(水平1、水平2)室內質控的年度CV，計算出中位數CV作為分析變異CVa，查詢肌酐在健康人群中變異CVi(https://www.westgard.com/biodatabasedisease.htm)，Z值為標準正態分布的臨界值，取95%置信區間(Z=1.96)，利用公式比較兩種方法獲得的參考區間之間的偏倚是否在RCV的范圍之內。

2 結 果

2.1轉移法回歸方程的建立 利用305份血清的肌酐水平檢測結果，剔除離群值后建立兩種方法檢測肌酐水平的回歸方程，計算公式為Y=0.930 8X+7.639 9，R2=0.990 3(Y=苦味酸法檢測的肌酐水平，X=酶法檢測的肌酐水平)。

2.2苦味酸法檢測的肌酐水平參考區間和轉移后參考區間差異比較 間接法建立的參考區間與轉移法建立的參考區間見表1。結果顯示，隨著年齡增加，肌酐參考區間上下限也隨之增加，13歲之后的同年齡段男性與女性肌酐參考區間上下限有較大差異，呈增加趨勢，與兒童生長發育特點相符合。間接法與轉移法所確定的參考區間上下限在不同年齡和性別分組的相對偏倚較小。

表1 間接法建立的肌酐參考區間與轉移法建立的肌酐參考區間的差異比較

2.3確認兩種方法建立的參考區間偏倚 利用RCV值驗證參考區間，根據實驗室2018-2021年肌酐的年度CV，計算得CVa=2.5%，見表2。通過查詢數據庫得到肌酐的CVi=4.3%，計算RCV=13.8%。從間接法建立的參考區間和轉移法建立的參考區間上下限的的相對偏倚可以看出，除16～18歲男性肌酐上限的相對偏倚為-17.9%，其絕對值超過了肌酐的RCV外，其余結果均在13.8%以內，滿足參考區間驗證的要求。為進一步驗證16～18歲男性肌酐參考區間是否適合本地區人群，從LIS數據庫中篩選出2018-2021年16～18歲體檢男性數據67條，剔除1例明顯異常數據，共有5條數據在轉換后的參考區間56～102 μmol/L之外，未通過比例為7.6%(<10%)，滿足EP28-A3c中關于參考區間驗證數據大于20例時，參考區間以外數據<10%的要求，驗證通過。

表2 2018-2021年實驗室肌酐年累計CV(%)

3 討 論

CLSI指南中對于參考區間建立時參考個體的選擇有兩種方式，一種方式稱之為先驗，即為標準的參考個體篩選方式，通過納入嚴格的排除標準，經過正規評價、表觀調查篩選出合適的參考人群；另一種方式稱之為后驗，即從參加健康體檢、疾病預防或者雖患病但證明對研究項目沒有影響的非健康人群中獲取大量的已進行醫學檢驗的人群數據，通過預設的排除標準獲得參考個體[2]，后驗的優勢在于較便捷的獲取大量的相關數據，節省人力物力，不足之處在于所獲得的數據較先驗方式會存在一定的偏倚，間接法參考區間的建立就是來自后驗方式。

實驗室引用某一項目的參考區間，需要經過生物參考區間的綜合評估及選擇、驗證、臨床評審后，才能應用于臨床。在選擇參考區間時，應根據實驗室的檢測體系、質量要求以及適用人群，選擇適合本實驗室的參考區間。當實驗室檢測系統及適用人群與所選參考區間有差異時，在滿足所引用參考區間建立時的分析系統與實驗室使用相同或具有可比性的標準物質或校準物質，有相近的不精密度、干擾，報告單位及方法學比較試驗在可接受的范圍內時，可以將所引用的參考區間轉移到現有的分析系統。用回歸方程來檢驗兩者的關系，其標準為線性關系擬合較好(r>0.90)且沒有高階項存在(比如沒有二次方項X2)時，可以用回歸模型來實現參考區間上下限的轉移[11]。EP28-A3c中關于參考區間的驗證，明確規定對于每一分層數據選用20例健康個體進行驗證，3例及以上(>10%)超出范圍則需要重新選擇20例再進行驗證，再次驗證失敗則證明此參考區間不適用于本實驗室，需要重新選擇或自建參考區間。這里需要關注的是如果提供的參考區間過寬，那么使用20個值進行驗證，大概率會落入到參考區間內，這時就需要較大的樣本量(如40個)或重復驗證來減少落入參考區間內的概率[2]。實驗室獲得的參考區間還需要經過臨床評審，來驗證是否能滿足臨床需要。

酶法和苦味酸法是檢測肌酐水平的主要方法，這兩種檢測方法在檢驗領域應用范圍很廣，在臨床應用中各有其優缺點：影響酶法檢測肌酐水平的干擾物質主要有羥苯磺酸鈣、酚磺乙胺、膽紅素、維生素C等，影響苦味酸法檢測肌酐水平的干擾物質主要是維生素C、蛋白質、丙酮酸以及頭孢唑啉、青霉素G等抗菌藥物[12]，對于常用這些藥物的人群應尤其關注其對于肌酐水平的影響。WS/T 780-2021中明確指出，兒童肌酐水平檢測方法為酶法，計量學溯源到同位素稀釋質譜法[8]，本院對兒童肌酐水平的檢測方法為苦味酸法，與酶法的溯源一致，故可以轉移參考區間。從轉移后的回歸方程可以看出，兩者的線性關系較好，滿足兩個系統間轉移的條件，轉移后的參考區間經過驗證滿足要求。EP28-A3c指南中指出，通過建立嚴格的篩選標準，選取合適及足量的參考個體是建立生物參考區間的標準方法(直接法)，同時指南中允許利用間接法建立參考區間。利用間接法建立參考區間，可以充分利用現有數據，運用適當的統計學方法對醫院數據庫中合適的數據進行正態轉換，剔除離群值，建立不同性別、年齡的生物參考區間。雖然利用LIS獲得的數據經過了嚴格的篩選，但仍然會存在一定數量的離群值，但相關研究證實，即使在30%偏態數據的干擾下，其對最終結果的影響較小[13]。

本文通過對比研究驗證了轉移法建立參考區間的可行性，為難以獲得標本的人群，如新生兒、嬰幼兒、老年人等血液指標參考區間的建立提供了一種較為可行的方法，當實驗室不能直接引用或建立參考區間時，在滿足所服務人群及實驗室分析系統具有可比性的前提下，可考慮采用參考區間轉移的方式，獲得適合本實驗室的參考區間。轉移的對象可以是行業標準、說明書或者實驗室之前建立的參考區間，但該方法不是參考區間建立的推薦方法，而是僅適用于上述特殊情況下的替代方法。通過間接法獲得的參考區間驗證轉移法參考區間，比較兩種方法的相對偏倚，以參考變化值作為驗證是否通過的依據，兩者結果相近，轉移后的參考區間可用于本實驗室。

本研究中，采用間接法計算所得16～18歲男性肌酐水平參考區間下限較轉換后參考區間下限相對偏倚較大，原因可能與該年齡段收集的數據較少有關，可適當擴大數據量，重新驗證。本研究不足之處在于僅采用本院數據，可能具有一定的局限性，且13～18歲數據偏少，仍需要增加檢測數據進行驗證。經過與臨床醫生咨詢和溝通，結合臨床經驗與實際情況分析，臨床普遍認同轉移后的參考區間可以作為本地區兒童肌酐水平參考區間。

綜上所述，經間接法驗證，轉移法建立的兒童肌酐水平參考區間符合要求，可作為實驗室本地區兒童肌酐水平的參考區間。