高效液相色譜法測定保健食品中5種雌性激素

陳 潔

（寧德市食品藥品檢驗檢測中心，福建 寧德 352100）

雌性激素（estrogen）又稱女性激素，分為雌激素和孕激素兩大類，是女性重要的荷爾蒙。適當補充低劑量的雌性激素可達到改善皮膚狀態、延緩老化、刺激并維持女性第二性征（如促使乳房發育、增大）、增強骨骼硬度、降低落齒率等效果[1-4]，也可減輕女性更年期潮紅出汗、心慌氣急、煩躁易怒等癥狀[5-7]?，F代醫學研究表明，通過食物也可補充雌性激素，個別雌性激素嚴重偏低者可在醫生指導下服用雌性激素藥品；但不可擅自補充，服用不當者可能導致身體內分泌失調，損傷生殖器官，增加罹患乳腺腫瘤和子宮內膜病變幾率的風險[8-13]。

由于女性生活節奏、工作節奏加快，更年期提前、睡眠不好、壓力大、焦躁不安等問題也隨之出現[14-17]。市面上宣稱有改善睡眠、美容養顏、延緩衰老的保健食品也受到這部分消費者的歡迎。一些不法商家追求低成本、見效快、功能強的目的，很可能在此類保健產品中添加雌性激素類化學藥物，危害消費者身體健康。

目前，國內尚未出臺保健食品中雌性激素檢測的相關標準。文獻報道的檢測方法主要有液相色譜-質譜聯用法[18-21]，氣相色譜-質譜聯用法[22-24]，高效液相色譜法[25-27]、酶聯免疫法[28-29]、熒光法[30-31]等。液相色譜儀因其價格相對便宜，準確度、精密度高，操作簡便、快速，因而受到更廣泛應用，是近年研究的主要方向。本文建立了高效液相色譜法同時測定保健食品中5種雌性激素，對完善保健食品檢驗標準體系、為市場監管提供技術依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀[配有DAD檢測器，安捷倫科技（中國）有限公司]；XPE 105電子天平（Mettler Toledo）；SQP電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；WP-UP-YJ-20S超純水機（四川沃特爾水處理設備有限公司）。

1.2 材料

對照品信息：見表1。乙腈、甲醇：色譜純；實驗用水：一級水。樣品為市售女士口服液。

表1 對照品信息

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 標準溶液配制 標準儲備液：取對照品適量，精密稱定，置入50 ml量瓶，甲醇定容至刻度線，混勻，得1 mg/ml的標準儲備液。

標準使用液：臨用前，準確移取上述1 mg/ml標準儲備液1 ml置入10 ml量瓶，甲醇定容至刻度線，混勻，得 100 μg/ml的標準使用液。

2.1.2 樣品前處理 準確稱取樣品1 g（精確到0.001 g）置入10 ml具塞離心管，加入5 ml甲醇，超聲10 min，取出，用甲醇定容至刻度線，經0.45 μm有機濾膜過濾后上機測定。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（60:20:20）；流速：0.8 ml/min；檢測波長：230 nm；進樣量：10 μl；柱溫：40 ℃。

2.3 色譜條件優化

分別對比樣品甲醇溶液、5種雌性激素混合標準溶液（濃度為10 μg/ml）和加入雌性激素標樣的樣品甲醇溶液（濃度為10 μg/ml），用不同的流動相（甲醇-水，乙腈-水以及甲醇-乙腈-水）進樣測試，觀察各組分分離效果。結果表明，以甲醇-乙腈-水=60:20:20作為流動相，流速0.8 ml/min時，可達到理想的分離效果，色譜圖見圖1～圖3。

圖1 5種雌性激素混合標準溶液的色譜圖

圖2 樣品甲醇溶液的色譜圖

圖3 加入雌性激素標樣的樣品甲醇溶液的色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 檢出限、定量限及線性關系的考察 準確移取適量100 μg/ml標準使用液，用甲醇稀釋成濃度為5，10，20，30和50 μg/ml系列標準工作溶液，按2.2項色譜條件檢測，以目標物濃度（X，μg/ml）為橫坐標，相應的峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線；以3倍信噪比確定方法檢出限，10倍信噪比確定方法定量限。結果見表2。

表2 5種雌性激素的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

由表 2 可見，在 5～50 μg/ml濃度范圍內，5種雌性激素的線性方程相關系數 r2≥0.999 91，線性關系良好；方法檢出限為 0.24～0.84 mg/kg，定量限為0.80～2.82 mg/ kg，表明本法靈敏度好，準確度高。

2.4.2 精密度和穩定性 在6個空白樣品中添加適量標準使用液，使每個空白樣品中最終加標濃度為10 μg/ml，按照2.1.2項制備樣品，按2.2項色譜條件測定，記錄出峰時間及峰面積；并在0，2，5，8，10，24 h 各進樣1次，記錄不同時間段各目標物的峰面積變化，計算相對標準偏差。結果見表3。

表3 5種雌性激素的精密度和穩定性

由表 3 可見，加標濃度為10 μg/ml的6個平行樣中5種雌性激素的峰面積RSD為0.17 %～0.25 %，保留時間RSD為0.10 %～0.14 %，無明顯變化；24 h內5種雌性激素的峰面積RSD為0.12 %～0.22 %，峰面積變化相對穩定。綜上，表明本試驗方法精密度佳，穩定、重現性良好，可適用于保健品中5種雌性激素的檢測。

2.4.3 方法回收率 在空白樣品中添加3種不同濃度的標準混合溶液，按2.1.2制備樣品，按2.2色譜條件進行6水平測定，計算各目標物回收率。結果見表4。

表4 5種雌性激素的平均回收率和相對標準偏差表（n=6）

由表4可見，各目標物回收率為90.0 %～103.1 %，RSD為0.98 %～1.27 %，滿足GB/T 27404-2008的質控要求。進一步說明本法準確度高，精密度好，滿足保健品中5種雌性激素同時測定的要求。

2.5 樣品測定

采用本研究建立的方法，對市售10批次宣稱具有祛斑、美容養顏功效的女士口服液進行分析檢測，結果表明，5種雌性激素含量均低于檢出限。

3 討論

本研究建立了一種同時測定女士口服液中雌三醇、己烯雌酚、雌二醇、雌酮和黃體酮等5種雌性激素含量的高效液相色譜方法。該法操作簡便，準確度高，重現性好，靈敏度強，能有效提高保健食品中雌性激素的檢測效率，為市場監管部門提供技術依據。本次檢測的市售10批次宣稱具有祛斑、美容養顏功效的女士口服液，5 種雌性激素含量均低于檢出限，表明在法律和相關部門的監管下，抽檢樣品中未發現假劣藥物和保健品非法添加情況。仍提醒消費者應通過正規渠道購買保健食品，如發現制假售假或購買到有問題商品應及時向政府部門報告。