氣相色譜法測定食品中環己基氨基磺酸鈉方法研究

于艷麗

（上海杉達學院，上海 201209）

環己基氨基磺酸鈉，別名甜蜜素，是GB2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》允許使用的人工合成甜味劑，可廣泛用于調味品、果醬、果凍、冰淇淋、糕點、蜜餞、飲料等食品，同時還可以與其它甜味劑混合使用，是目前我國食品行業中應用較多的一種甜味劑，其甜度約為蔗糖的30倍，風味較自然，后苦不明顯，熱穩定性高，是不被人體吸收的低熱能甜味劑[1]。環己基氨基磺酸鈉作為一種食品添加劑，其安全性在世界范圍內仍然存在爭議，在我國雖然國標中規定了明確的使用限量，但是超標現象時有發生[2-3]，所以對食品中環己基氨基磺酸鈉的檢測方法進行研究非常必要。環己基氨基磺酸鈉檢測方法很多，GB5009.97-2016《食品安全國家標準食品中環己基氨基磺酸鈉的測定》中規定了3種方法：氣相色譜法[4-9]、液相色譜法[10-12]和液相色譜-質譜/質譜法[13-14]。其他研究還有氣相色譜-質譜法[15-16]，毛細管電泳/電導法[17]、核磁共振波譜法[18]等。在這些方法中，氣相色譜法最經典，關于其實驗條件的優化也較多[18]。其實驗原理是食品中的環己基氨基磺酸鈉用水提取后，在硫酸介質中與亞硝酸反應，生成環己醇亞硝酸酯，酯不穩定部分分解為環己醇，而二者的峰面積之和保持穩定，故定量計算可用兩者峰面積之和，采用外標法定量。不同研究關于實驗條件優化多集中于反應試劑用量、時間和酯化溫度等，關于萃取劑的種類選擇和冷凍時間研究較少。本文建立氣相色譜外標法測定食品中環己基氨基磺酸鈉的方法，主要探討冷凍時間、萃取劑種類、色譜柱溫條件的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890B型氣相色譜儀（美國安捷倫公司，附FID檢測器）；AL204電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SORVALL ST16R離心機（美國賽默飛公司）。

1.2 試藥

環己基氨基磺酸鈉對照品（99.9 %，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；正己烷、環己烷、正庚烷（色譜純，美國Fisher公司）；石油醚（沸程為30～60 ℃）；硫酸，亞硝酸鈉，亞鐵氰化鉀，硫酸鋅，氯化鈉（分析純）?；鹜?、碳酸飲料、話梅、奶香味瓜子、黃桃罐頭、虎皮蛋糕、冰糖雪梨飲料、蔥姜料酒均購自某電商平臺。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細管柱（30 m× 0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度80 ℃保持1 min，以5 ℃/min升溫至90 ℃保持0.5 min，以40 ℃/min升溫至 200 ℃保持2 min；進樣口溫度：230 ℃；檢測器：FID，檢測器溫度：260 ℃；進樣量：2 μl；載氣：氦氣，流量1 ml/ min；尾吹流量（He）：25 ml/ min；空氣流量：400 ml/ min，氫氣流量：40 ml/ min；分流比：5:1。

2.2 樣品處理

高脂樣品如火腿：稱取打碎、混勻的樣品5.00 g于50 ml 離心管中，加入25 ml石油醚，振搖，超聲提取3 min，再混勻，離心（1000 r/min以上）10 min，棄石油醚，再用25 ml石油醚提取1次，棄石油醚，60 ℃水浴揮發去除石油醚，殘渣加30 ml水，混勻，超聲提取20 min，加2 ml濃度為150 g/L亞鐵氰化鉀溶液，混勻，再加入2 ml濃度為300 g/L硫酸鋅溶液，混勻，離心（3000 r/min）10 min，過濾，用水洗滌殘渣，收集濾液并定容至50 ml，混勻備用。液體試樣處理如碳酸飲料：稱取25.0 g試樣于燒杯中，60 ℃水浴加熱30 min以除二氧化碳，放冷，用水定容至50 ml，備用。

2.3 標準溶液的配制

環己基氨基磺酸鈉標準儲備液（5.00 mg/ml）：稱取0.5000 g環己基氨基磺酸鈉對照品，加水溶解并定容至100 ml，即配得 5 mg/ml標準溶液。環己基氨基磺酸鈉標準中間液（1.00 mg/ml）：準確移取20.0 ml環己基氨基磺酸標準儲備液，用水稀釋并定容至100 ml，混勻。環己基氨基磺酸鈉標準系列：準確移取1.00 mg/ml環己基氨基磺酸鈉標準溶液0.50，1.00，2.50，5.00，10.0，25.0 ml，置入50 ml量瓶，加水定容，配成濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 mg/ml的系列標準溶液。

2.4 衍生化

準確移取10 ml系列標準溶液及樣品處理液分別置于50 ml帶蓋離心管中，離心管置試管架上-18 ℃冰柜中5 min后，加入2.5 ml濃度為50 g/L的亞硝酸鈉溶液，2.5 ml濃度為200 g/L的硫酸溶液，蓋緊離心管蓋，搖勻，在-18 ℃冰柜中放置15 min；加入2.5 g氯化鈉，蓋上蓋后置旋渦混合器上振動1 min，準確加入5.00 ml正己烷，低溫靜置5 min，分層后取上清液供氣相色譜分析。

2.5 色譜分析

分別吸取2 μl衍生化處理后的標準系列各濃度溶液及樣品處理液，注入氣相色譜儀中，獲取色譜圖，以保留時間定性，環己醇亞硝酸酯和環己醇兩峰面積之和定量。以標準溶液濃度為橫坐標，兩峰之和為縱坐標，繪制標準曲線，根據標準曲線得到樣液中的待測樣品濃度。

2.6 圖譜

對照品按2.4項步驟衍生化，按2.5項色譜條件進行測量，所得色譜圖見圖1。在此反應條件下的色譜圖呈現兩個峰型良好的色譜峰，保留時間分別為3.901，4.071 min，這是因為環己醇亞硝酸酯穩定性不高，發生分解轉化為環己醇的現象，前峰為酯化反應產物環己醇亞硝酸酯，后峰為環己醇。不過因為兩種物質并存，且保留時間接近，表現在色譜峰上的雙峰更容易識別，利于定性，定量時應以兩峰面積的加和計算。實際樣品檢測的圖譜和標準品相近，見圖2。

圖1 標品色譜圖

2.7 線性范圍與檢出限、定量限

取衍生化后的標準溶液系列在上述優化后的儀器條件下上機檢測，以環己基氨基磺酸鈉濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準工作曲線，獲得回歸方程Y= 6388.9X+5.36，相關系數r=0.99996。環己基氨基磺酸鈉含量在0.01～0.50 mg/ml有良好的線性關系。

固體空白樣品中添加 1.00 mg/ml標準溶液50 μl于5 g（即加標濃度為：0.010 g/kg），樣品經前處理，儀器測定后，被測物信噪比=3.3≥3，表明方法的檢出限可至0.010 g/kg，定量限可至0.030 g/kg。液體空白樣品中添加 1.00 mg/ml標準溶液250 μl于25 g（即加標濃度為：0.010 g/kg），樣品經前處理，儀器測定后，被測物信噪比=17.0≥3，表明方法的檢出限可至0.010 g/kg，定量限可至0.030 g/kg。

2.8 加標回收率

選取未檢出環己基氨基磺酸鈉的某品牌紅腸和某品牌的碳酸飲料，各稱取6份，紅腸每份5 g，碳酸飲料每份25 g，按表1 所示分別添加4個水平的環己基氨基磺酸鈉，計算加標回收率。紅腸的回收率在100.2 %～102.1 %之間，碳酸飲料的回收率在99.5 %～101.0 %之間。

表1 回收率和精密度試驗結果（n=6）

2.9 實際樣品檢測

用本方法對市售蜜餞、炒貨、水果加工制品、糕點、飲料、調味品等六大類食品進行分析。分別挑選市售話梅、奶香味瓜子、黃桃罐頭、虎皮蛋糕、冰糖雪梨飲料、蔥姜料酒各10個樣品進行檢測分析。檢測結果表明，話梅和奶香味瓜子的檢出率均為100 %，但是均未超標；虎皮蛋糕和蔥姜料酒未檢出；黃桃罐頭、冰糖雪梨飲料檢出率低，分別有1個樣品檢出甜蜜素，含量分別為0.91 g/kg，0.84 g/kg，依據國標判定，甜蜜素含量超標。

3 討論

3.1 衍生化時間優化

探討最佳衍生化時間，加入衍生試劑后的離心管分別在-18 ℃冰柜中冷凍放置0，5，10，15，20，30，40 min，獲得不同衍生化時間后的色譜峰峰面積，見圖3。0～40 min的不同衍生化時間內，酯的峰面積優勢明顯，均約260，醇峰面積均約9.5，表明在此條件下由酯向醇的轉化較少。直接上機測量的0 min樣品，峰面積已達最大值，和其他衍生化時間的峰面積無顯著差異。表明酯化反應瞬時發生，亞硝酸鈉和硫酸溶液加入并充分搖勻后，酯化反應已經完成。這和梁曉涵[22]認為的的衍生化反應在10 min后回收率最大的結論不同。本文認為，-18 ℃冷凍時間對于衍生化反應的影響較小，冷凍的意義更多是來自于大批量樣品的同步處理而產生漫長等待上機時間時兩個方面的影響：一是低溫有效減少待測物質的揮發，二是減緩環己醇亞硝酸酯向環己醇的轉化速度。江豐等[23]認為當正庚烷提取液處于酸性條件時，環己醇亞硝酸酯不會發生水解反應生成環己醇。本文認為溫度同樣是一個重要的因素。

圖3 不同衍生化時間的峰面積

對于冷凍時間的選擇，本文建議對于批量樣品的檢測，-18 ℃冷凍衍生化時間可選擇30 min，而較少樣品的測定冷凍衍生15 min即可，本文后續實驗衍生化條件選取-18 ℃冷凍15 min，替代國標冰浴30 min。筆者欲考慮更長的冷凍衍生化時間的影響，但是體系50 min后開始結冰，考慮到等待冰融化才可測量的時間內，亦會發生環己醇亞硝酸酯向環己醇的轉化，且會增加檢測等待時間，更長的冷凍時間則無必要。

3.2 提取劑的選擇

分別采用正己烷、環己烷、正庚烷作為提取劑所獲色譜圖，見圖4。3種提取劑提取衍生化產物后進行測定，均獲得環己醇亞硝酸酯和環己醇兩個比較明顯的色譜峰，主峰保留時間一致，均在3.9 min，且峰型良好。按照正己烷、環己烷、正庚烷的順序，三者作為溶劑所獲得的色譜峰的峰寬逐漸變窄，峰型變得更為尖銳，環己烷和正庚烷作為提取劑所測量的峰面積也略大于正己烷。

圖4 不同提取劑色譜圖

正庚烷所獲得色譜圖顯示，除環己醇亞硝酸酯和環己醇的色譜峰外，二者之間出現一個明顯的雜峰，且無法和待測物峰有效分離。三種提取試劑的空白實驗所獲色譜圖如圖5所示。由圖5C來看，正庚烷在環己基氨基磺酸鈉出峰時間（4 min左右）有幾個明顯的小的雜峰，正庚烷不是測量環己基氨基磺酸鈉的理想提取劑。同樣，環己烷也不是測定環己基氨基磺酸鈉的理想提取劑。雖然正己烷作為提取劑所獲峰面積稍小，但是峰型良好，在此時間段內無雜峰干擾，是測量環己基氨基磺酸鈉的理想提取溶劑。

圖5 試劑空白色譜圖

3.3 色譜柱溫升溫程序優化

考察3種不同的色譜柱溫度條件對色譜圖的影響，見圖6。A恒溫程序：恒溫80 ℃，保持6 min，200 ℃后運行2 min。B程序升溫：初溫80℃保持1 min，5 ℃/min升溫至90 ℃保持0.5 min，40 ℃/min升溫至 200 ℃保持2 min。C程序升溫：初溫55 ℃保持3 min，10 ℃/min升溫至90 ℃保持0.5 min，20 ℃/min升溫至 200 ℃保持3 min。由圖6可見，3種柱溫條件都能獲取可供準確分析的色譜圖。C也是國標方法中的升溫程序，色譜峰的兩峰面積和最大，峰型最尖銳，且兩峰完全分開，實現基線分離。A和B所獲色譜峰的色譜峰面積相當，分別是172和168，從色譜峰來看，C檢測效果最佳。從所需時間來看，C需求時間為15.5 min，B為8.25 min；A為8 min，A和B檢測時間大大縮短，檢測效率高?？紤]到恒溫程序對色譜柱的污染較大，在兼顧效率和色譜柱壽命的情況下，選擇B柱溫條件。

圖6 不同柱溫程序色譜圖

4 結論

環己基氨基磺酸鈉與亞硝酸鈉的酯化反應是瞬間完成的，-18 ℃的冷凍條件能有效減少待測物的揮發及環己醇亞硝酸酯向環己醇的轉化；冷凍時間長短，可依據批量檢測的樣品數確定。提取劑正己烷與環己烷和正庚烷相比，無雜峰干擾，是一種理想的提取試劑及溶劑；色譜柱溫的升溫條件：初溫80 ℃保持1 min，5 ℃/min升溫至90 ℃保持0.5 min，40 ℃/min升溫至 200 ℃保持2 min，可進行有效快速分析，并兼顧色譜柱壽命及檢測效率。

本文實驗條件和國標相比，檢測時間顯著縮短，其一來自衍生化過程冷凍時間的縮短，-18 ℃冷凍15 min，替代國標冰浴30 min。其二來自于色譜柱程序升溫時間的減少，現有程序的8.25 min替代國標的15.5 min。通過固體樣品香腸和液體樣品碳酸飲料的加標實驗驗證，證實本方法有很好的準確度和精密度，滿足固體及液體食品樣品中環己基氨基磺酸鈉含量測定的方法要求。