防己諾林堿藥理作用研究進展

王斐然，張會敏，林永強，張秋紅

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014；3.山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥監局膠類產品質量評價重點實驗室，山東省中藥標準創新與質量評價工程實驗室，中藥配方顆粒共性技術山東省工程研究中心，山東 濟南 250101；4.濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南 250102）

防己是防己科植物粉防己（Stephania tetrandra S.Moore）的干燥根[1]。防己始載于《神農本草經》，具有祛風止痛，利水消腫的功效，用于風濕痹痛、水腫腳氣、小便不利、濕疹瘡毒、癬疥瘡腫、高血壓等病癥[2-3]。目前由防己分離的化學成分主要包括生物堿類、黃酮類、多糖、揮發油、甾體類等[4-6]，其中生物堿中的防己諾林堿是多種藥理作用的重要活性物質之一。

防己諾林堿（fangchinoline，Fan）是從防己中分離得到的一種單體化合物（結構見圖1），別名粉防己乙素、漢防己乙素、去甲基粉防己堿?，F代藥理學研究表明Fan有廣泛的生物活性，如：抗氧化應激、抑制主動脈血管平滑肌細胞增殖、降血壓、抑制組胺釋放和抗腫瘤等活性[7-10]。本文通過查閱國內外文獻，對Fan的藥理作用進行綜述。

圖1 防己諾林堿的結構式

1 抗腫瘤作用

惡性腫瘤細胞具有分化和增殖異常、生長失去控制、浸潤性和轉移性等生物學特征[11]。研究表明，Fan具有廣譜抗腫瘤作用，主要通過抑制同源重組（HR）、AMP依賴的蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/ UNC-51樣激酶1通路（AMPK/mTOR/ULK1）、缺氧誘導因子1α/血管內皮生長因子/蛋白激酶B（HIF-1α/VEGF/Akt）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、核轉錄因子κB（NF-κB）、激活蛋白1（AP-1）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路發揮抑制腫瘤細胞的細胞周期、減少腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡等作用。防己諾林堿抗腫瘤作用機制見表1。

表1 防己諾林堿抗腫瘤作用機制

1.1 抗結膜黑色素瘤的作用

Bao等[12]使用免疫缺陷的NCG小鼠皮下注射CM-AS16細胞，通過灌胃不同濃度Fan作為治療組發現，Fan成劑量依賴性減小實體瘤的體積，且Fan治療組小鼠血清中丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸氨基轉移酶、肌酐和尿素水平與空白組無顯著性差異，表明Fan對小鼠肝腎功能無損害；蛋白質印跡法（WB）和逆轉錄多聚酶鏈式反應（RT-PCR）實驗結果表明，Fan可抑制腫瘤細胞中BRCA1、BRCA2、RAD50和RAD51基因的表達，并直接與FUBP2蛋白結合，抑制HR通路，抑制腫瘤細胞的生長和增殖。

1.2 抗大腸癌的作用

Xiang等[13]采用體內外實驗發現Fan可激活大腸癌細胞系HT26和HTC116中AMPK/mTOR/ULK1通路，自噬標志物 LC3-II和細胞自噬受體蛋白p62降解水平增加，促進自噬小體和點狀結構形成，誘導細胞自噬，增加細胞凋亡；裸鼠皮下移植實體瘤進行體內驗證發現，Fan可縮小大腸癌實體瘤的體積。望永鼎等[14]用Fan處理結腸癌細胞HT-29，48 h后發現克隆形成率顯著降低，上皮細胞鈣黏蛋白表達量上調，神經鈣黏蛋白等表達顯著下調，并經Fan治療移植瘤后腫瘤體積縮小，且HIF-1α、VEGF和Akt的表達量下降，進一步驗證了Fan通過抑制HIF-1α/VEGF/Akt信號通路對結腸癌產生治療作用。Jiang等[15]發現Fan可阻斷表皮生長因子受體（EGFR）的表達，通過抑制PI3K/Akt信號通路預防結腸癌，對人結腸腺癌DLD-1和LoVo細胞的細胞毒、細胞活性和增殖能力的作用呈劑量依賴性增長；用流式細胞儀發現Fan可誘導結腸腺癌Coad細胞凋亡和G1細胞周期阻滯，同時建立裸鼠異種移植瘤模型進行體內驗證，結果表明，Fan有效抑制結腸腺癌細胞增殖、遷移、干化、侵襲和血管生成，誘導細胞凋亡。

1.3 抗白血病的作用

Xu等[16]發現粉防己堿和Fan的化學2D結構相似度可達到0.88，3D結構相似度可達到0.98，Fan對柔紅霉素耐藥的MOLT-4人急性T淋巴母細胞白血病細胞的P-糖蛋白具有顯著抑制作用。Jung等[17]發現Fan可抑制人慢性髓原白血病細胞系KBM5和人多發性骨髓瘤細胞系U266的增殖生長；WB實驗表明，Fan抑制IκB和p65的磷酸化，進而抑制NF-κB和AP-1兩條通路的活化，阻滯KBM5和U266細胞生長，酶聯免疫和DNA缺口末端標記法表明，Fan還能顯著增強腫瘤壞死因子-α（TNF-α）活性，抑制細胞增殖，裂解DNA修復酶，誘導細胞凋亡。

1.4 抗非小細胞肺癌的作用

陳瀾濤等[18]通過檢測含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase 3）、Caspase 8和Caspase 9等表達發現，Fan隨濃度升高可逐漸提高肺癌H1299和A549細胞中細胞DNA內切酶活性，且降低細胞中凋亡相關蛋白（MCL-1、Bax和p53）和轉移相關蛋白[基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、增殖細胞核抗原、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）]的表達，RT-PCR檢測表明，細胞中MAPK信號通路的p-Akt、PI3K、mTOR表達被抑制，進而阻滯H1299和A549細胞停留在G0/G1期，促進細胞凋亡。

Luo等[19]采用吉姆薩染色和流式細胞術技術發現，Fan使人肺癌SPC-A-1細胞活性減弱；WB和PCR結果表明，Fan阻滯Cyclin D1表達，下調腫瘤細胞內細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）、CDK6和Cyclin D1蛋白的水平，顯著降低細胞周期關鍵基因（Cyclin D1、CDK4和CDK6）的mRNA表達水平，抑制E2F轉錄因子-1活性，明顯阻滯SPC-A-1肺癌細胞的增殖。

1.5 抗乳腺癌的作用

Wang等[20]發現Fan呈劑量依賴性抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，經Fan治療細胞內MMP-2和MMP-9含量下降。WB檢測結果表明 Fan使MDA-MB-231內NF-κβ蛋白表達降低，Iκβ蛋白表達水平升高，同時下調PI3K/AKT/mTOR信號轉導通路，誘導細胞凋亡。張艷輝等[21]發現Fan可有效減小三陰乳腺癌實體瘤的體積，并利用噻唑藍比色法計算出Fan對三陰性乳腺癌細胞BT549的IC50為8.99 μmol/L，BT549細胞的Smo、Gli1蛋白表達水平明顯降低，通過抑制Hedgehog通路促進腫瘤細胞凋亡，且細胞的凋亡程度與Fan的濃度呈正相關。

1.6 抗其他腫瘤的作用

研究表明，Fan還可治療其他腫瘤疾病。Fan作用于膀胱癌細胞株T24和5637后可降低細胞內ATP水平；細胞中增殖細胞核抗原表達下調，LC3-II/LC3-I比值上調，p62水平下調，通過抑制腫瘤細胞的mTOR通路，促進膀胱癌細胞株的凋亡，誘導膀胱癌細胞發生自噬[22]。此外，Fan對于胰腺癌也有治療作用，Lee等[23]發現Fan可通過清除細胞內的活性氧（ROS）抑制胰腺癌細胞MiaPaCa-2和PANC-1的增殖；且Fan是一種天然的孤兒核受體核受體亞家族4組A成員1 （NR4A1）抗劑，可通過抑制MiaPaCa-2和PANC-1細胞中Sp1蛋白依賴的反式應激拮抗NR4A1的表達，促進胰腺癌細胞凋亡。Li等[24]發現Fan可以明顯降低骨肉瘤MG63和U20S細胞中Aktp-Thr308表達，細胞周期阻滯；此外，還可下調MG63細胞PI3K通路及下游的Cyclin D1和MMP-2和MMP-9表達，上調caspase-3和caspase-8蛋白表達，呈劑量依賴性抑制MG63和U20S細胞增殖，降低MG63細胞的遷移和侵襲能力，促進人骨肉瘤細胞的凋亡。王迅等[25]使用不同濃度的Fan處理人膠質母細胞瘤U251 細胞，通過劃痕實驗檢測發現Fan 呈劑量依賴性抑制 U251 細胞的遷移能力，且12，24及48 h后Fan均可有效抑制細胞活力；在分子機制研究中，Fan處理后U251 細胞中 Akt 蛋白質磷酸化水平降低，抑制Akt通路，阻滯細胞生長，促進U251的凋亡。

2 抗骨質疏松作用

周琳等[26]利用Fan治療去除卵巢誘導的骨質疏松小鼠模型，結果表明，抗酒石酸酸性磷酸酶、I型膠原羧基末端肽及I型膠原氨基末端肽表達顯著下降，通過Micro-CT評估實驗組小鼠骨組織微結構相關指標（骨小梁百分比、骨小梁數量和骨小梁厚度）顯著升高，骨小梁分離度顯著降低，檢測發現Fan治療小鼠骨質疏松骨吸收相關基因（抗酒石酸酸性磷酸酶、組織蛋白酶K、活化T細胞核因子1和降鈣素受體）表達顯著下降，表明Fan對去卵巢小鼠骨質疏松有保護作用。Zhou等[27]利用新鮮分離的C57BL/6小鼠骨髓巨噬細胞發現Fan可減弱骨髓巨噬細胞NF-κB受體誘導的信號轉導，下調骨質疏松小鼠T細胞核因子1的活性和表達而不影響IκBα降解和絲裂原活化蛋白激酶通路，Micro-CT分析發現股骨的骨小梁百分比、骨小梁數量和骨小梁厚度呈劑量依賴性增加，骨小梁分離度降低，表明Fan對骨質疏松的骨組織有保護作用。徐志平等[28]對大鼠骨質疏松模型腹腔注射不同劑量濃度Fan 1個月，檢測發現Fan呈劑量依賴性提升自噬相關基因（ATG）的表達，例如顯著增強了ATG-5、轉錄因子2、Beclin-1和骨形態蛋白2的表達，并顯著降低股骨組織中NF-κB受體活化因子配體表達，表明Fan是通過增加自噬實現預防骨質疏松大鼠骨質流失。

3 抗炎作用

炎癥反應是人體對外界刺激的一種防御反應，表現為紅腫熱痛，大多數炎癥反應對人體有益，但失調的炎癥反應會對機體產生損傷，如糖尿病腎病、風濕性關節炎和神經細胞炎癥等。

Chen等[29]實驗表明，Fan能顯著減少急性心功能不全大鼠模型的單核細胞趨化蛋白-1、TNF-α、白細胞介素（IL-1β）、IL-18和IL-6等炎性細胞因子釋放；此外，Fan處理后提高了超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低丙二醛的含量，同時顯著抑制p65、細胞外調節蛋白激酶1/2和NF-κB的磷酸化，進而抑制內毒素應激大鼠心肌細胞的凋亡，減輕心肌損傷。

Jiang等[30]用高脂飼料喂養大鼠4周，單次腹腔注射鏈脲霉素（30 mg/kg）誘導糖尿病腎病，實驗組每日1次口服Fan進行治療，大鼠血清中IL-6和TNF-α水平明顯降低，Fan可抑制MMP-9、環氧化酶2和TNF-α表達，降低異常表達的p38-MAPK；對大鼠腎臟進行組織切片染色發現Fan可減輕氧化應激和炎癥造成的腎臟損傷，發揮腎臟保護作用。

Villa等[31]用不同濃度的Fan處理人成纖維樣滑膜細胞（FLS）1 h后給予IL-1β（10 ng/ml）刺激，Fan處理后細胞活性無變化，但ROS測定和WB分析表明，Fan可減少產生人FLS細胞炎性細胞因子和ROS，減少人FLS細胞MAPK通路和NF-κB通路磷酸化；角叉菜膠/高嶺土關節炎大鼠模型用組織病理學技術和蘇木精-伊紅染色對大鼠左膝關節進行處理，與未經治療的關節炎組相比，治療組大鼠的炎癥評分均明顯降低，在組織學照片中表現得尤為明顯，表明Fan可改善炎癥關節紅腫熱痛的癥狀，改善炎癥體征，抑制關節炎小鼠膝關節軟骨降解。Shan等[32]使用Fan連續治療類風濕性關節炎模型大鼠21 d后，血清中異常表達的脂質過氧化物、谷胱甘肽、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶恢復到接近正常水平；Fan組TNF-α、IL-6、MMP-3和前列腺素E2水平下降，NO、尿酸、銅藍蛋白和銅的含量降低，但鋅含量增加，風濕性關節炎的炎癥反應降低。

Bao等[33]利用谷氨酸誘導神經元HT22細胞氧化性損傷，向其中加入核因子E2相關因子2（Nrf2）抑制劑Brusatol（80 nmol/L）2 h后加入Fan，噻唑藍比色法法檢測表明，Fan成劑量依賴性阻止HT22細胞死亡，顯著減輕細胞內ROS過量產生，逆轉谷氨酸引起的SOD活性下降，RT-PCR發現Fan有效上調HT22細胞中異常下降的Nrf2和血紅素加氧酶的水平，siRNA瞬時轉染表明Fan可在mRNA水平和蛋白質水平下調Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1的表達，抑制谷氨酸氧化產生的神經毒性。

Han等[34]對新生大鼠右側頸總動脈結扎建造腦缺血模型，連續3 d腹腔注射Fan進行治療后發現，Fan可降低缺血動物模型后腦組織異常升高的IL-1β和TNF-α；組織病理學研究表明，與缺血空白模型相比，Fan組大鼠腦組織髓鞘堿性蛋白含量明顯升高，腦損傷百分率明顯降低；此外，Fan治療組大鼠腦組織中誘導型一氧化氮合酶、VEGF、p53和Nrf2的表達減弱，改善新生大鼠腦缺血后神經元變性中血管生成分子的表達，以此善新生大鼠腦缺血誘導的神經元損傷。

4 藥物的其他藥理作用

4.1 抗病毒的作用

Kim等[35]利用HCoV-OC43病毒感染MRC-5人肺細胞后給予Fan進行治療，Fan在感染的MRC-5人胚肺細胞早期可抑制病毒S和N蛋白的表達，并降低感染細胞中IL-1β、IL-6和IL-8的表達，阻滯HCoV-OC43病毒的復制，使MRC-5細胞存活率顯著上升，且治療作用呈劑量和時間依賴性。Wan等[36]利用HIV-1cDNA轉染人胚腎細胞系HEK293T后給予Fan進行治療，Fan能抑制HIV包膜蛋白HIV-1糖蛋白160的加工，導致包膜糖蛋白進入新生病毒粒子減少，進而抑制感染性病毒粒子產生，主要作用于HIV感染晚期階段。

4.2 抗糖尿病視網膜病變的作用

Wu等[37]通過腹腔注射鏈脲佐菌誘導大鼠產生糖尿病視網膜病變模型，研究發現Fan可使異常表達的晚期糖基化終產物、血漿糖化血紅蛋白和血糖濃度明顯下降，減輕視網膜組織勻漿中氧化應激指標及炎癥細胞因子（VEGF、TNF-α、IL-1b、IL-6）的表達，抑制晚期糖基化終產物基因表達，視網膜組織中NF-κB表達下降，細胞凋亡指數有效降低，減輕糖尿病后期誘發的視網膜形態改變。

4.3 抑制瘢痕生長的作用

宋英莉等[38]利用原代瘢痕組織成纖維細胞進行實驗發現，Fan可呈劑量依賴性地抑制瘢痕組織成纖維細胞的增殖能力，抑制Cyclin D1和B淋巴細胞瘤-2基因在瘢痕組織成纖維細胞中的表達，對正常成纖維細胞的增殖無影響，表明Fan只對增生性瘢痕有抑制作用。

4.4 與腫瘤靶向藥物的協同作用

Fan與3-甲基腺嘌呤聯合用藥時，大腸癌HT29和HCT116細胞的存活率均顯著降低，同時對正常細胞無傷害，表明在Fan誘導細胞凋亡時3-甲基腺嘌呤可對正常細胞產生保護作用[13]。Kong等[39]研究表明，Fan-黃連堿/小檗堿對乙酰膽堿酯酶有協同抑制作用。何麗等[40]對耐藥卵巢癌細胞株SKOV3/ADM進行了Fan與紫杉醇的聯合用藥實驗，結果表明，Fan可促進紫杉醇的攝取率，逆轉癌細胞對紫杉醇長期用藥產生的耐藥性。Fan也可顯著提高吉西他濱對黑色素瘤細胞A375細胞株的促凋亡作用，還可提高結膜黑色素瘤CM-AS16細胞對順鉑、阿霉素的敏感性[12]。

5 總結與展望

Fan是從防己中提取分離得到的一種天然活性成分，對腫瘤、骨質疏松、炎癥、病毒感染、糖尿病誘導的視網膜病變等多種疾病均有治療作用。近年對于Fan的藥理研究已深入到細胞分子水平，可更加準確地闡述Fan的藥理作用機制。隨著研究深入，Fan針對不同疾病作用機制逐漸明確，通常是多種通路交互作用，可為未來的深入研究和疾病治療提供參考，但由于Fan屬于難溶性物質，口服生物利用度較低，限制了其臨床應用。隨著未來基因工程、代謝工程及分子生物學等現代科學技術發展，Fan類藥物極有可能開發出應用于臨床的成藥。