高效液相色譜法測定蜂蜜中諾氟沙星殘留

魏超田，高倩妮

（1.安徽正鑒檢驗檢測有限公司，安徽亳州 236800；2.安徽萬花草生物科技有限公司，安徽亳州 236800；3.亳州學院，安徽亳州 236800）

隨著人們對健康和天然保健產品的追求和崇尚，具有抗氧化性、抗菌性等生物活性功能的蜂蜜及其產品的質量受到了人們的廣泛關注。蜂蜜在養殖過程中會感染疾病或受到蟲害，峰農為控制病蟲害的發生而濫用抗生素，導致農藥殘留問題的發生。諾氟沙星屬喹諾酮類藥物，是在喹諾酮母核的基礎上進行人工合成的一類廣譜抗菌藥，因其價格低、抗菌性強，被廣泛用于人和動物疾病的治療[1]。但其自身無法分解，在人體內會大量積累殘留，人們食用動物組織后可能出現對該藥物的嚴重耐藥性。諾氟沙星在蜂蜜養殖過程中屬于禁用藥物，一經檢出即為不合格產品[2]。2019年國家市場監督管理總局對蜂蜜抽檢項目中，新增了幾項喹諾酮類，其中諾氟沙星殘留就是其中一項[3]。

目前測定諾氟沙星殘留量的方法有微生物法、高效液相色譜-紫外或二極管陣列檢測[4-6]、薄層色譜法[7-9]以及高效液相色譜-串聯質譜法（High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）)[10-13]。其中質譜法運用較多，質譜法雖然檢出限低但操作復雜、耗費時間長，且由于設備條件和成本的限制無法普及。相關學者對諾氟沙星藥物殘留的檢測方法研究大多集中在畜產品、奶制品、水產品上[14-16]，對于蜂蜜中的諾氟沙星殘留檢測較少，且動物性等產品的前處理方法不適用蜂蜜。本試驗通過研究蜂蜜不同的前處理方式，建立了一種簡單、經濟、高效、實用性強的高效液相色譜法測定蜂蜜中的諾氟沙星，以期為快速檢測蜂蜜中諾氟沙星含量奠定理論基礎，為蜂產品質量控制提供相應保證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾氟沙星標準樣品；乙腈（色譜純），甲酸、乙酸、氫氧化鈉、無水硫酸鎂、磷酸氫二鈉以及磷酸氫二鉀均為分析純，國藥基團；蜂蜜（5種不同品牌）購自超市。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（配有紫外、熒光檢測器），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；AcclaimTMPolarAdvantage Ⅱ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

準確量取 100 μg·mL-1的諾氟沙星標液 10 μL，用0.2%甲酸水溶液定容至1 mL，配制成1.00 μg·mL-1標準儲備液。準確移取儲備液按梯度稀釋配制成濃度為 0.001 μg·mL-1、0.002 μg·mL-1、0.004 μg·mL-1、0.080 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1和 0.200 μg·mL-1的 標準系列工作液，儲備于冰箱中備用。

1.3.2 高效液相色譜條件

色 譜 柱：AcclaimTMPolarAdvantage Ⅱ C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；熒光檢測波長：激發波長280 nm，發射波長450 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.5 mL·min-1；進樣量 10 μL；流動相：流動相 A（乙腈）∶流動相B（0.2%甲酸水溶液）為13∶87（體積比，下同）。

1.3.3 蜂蜜樣品處理

（1）蜂蜜稀釋液的選擇。①先用水溶解樣品，再用0.5%乙酸的乙腈溶液萃取蜂蜜中的諾氟沙星。②用0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液溶解樣品，再用0.5%乙酸的乙腈溶液萃取蜂蜜中的諾氟沙星。③用Mallvaine pH 4.0緩沖液溶解樣品，再用0.5%乙酸的乙腈溶液提取，最后水浴蒸發濃縮提取諾氟沙星。

稱取約5.00 g（精確到0.01）蜂蜜，加入5.0 mL 0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液，攪拌均勻，加入25 mL 0.5%乙酸乙腈溶液，渦旋5 min，加入無水硫酸鎂5 g，渦旋2 min，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液。

固相萃取柱依次用甲醇、磷酸緩沖鹽各2 mL預淋，取上清液過柱，10 mL甲醇洗脫，收集液水浴蒸至近干，0.2%乙酸水溶液溶解定容至2 mL，過0.45 μm有機濾膜，高效液相色譜儀分析測定。

（2）提取液的選擇。選取0.05 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液、0.5%乙酸的乙腈溶液、乙腈+水（8∶2）混合溶液為蜂蜜中諾氟沙星的提取液，考察不同提取液及其添加量對蜂蜜中諾氟沙星提取量的影響。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜方法的建立

2.1.1 流動相及其比例的確定

目前高效液相色譜法測定喹酮類含量時，一般選擇磷酸/三乙胺、磷酸/庚烷磺酸鈉、磷酸/四丁基溴化銨體系作為流動相分離喹諾酮類，但這幾種體系中都含有鹽類物質，易結晶，測定中容易造成色譜柱和檢測器堵塞，極大縮短了色譜柱的使用壽命。

試驗中發現熒光檢測器對含有乙腈的流動相變化較敏感，且在流動相中加入適量的甲酸可以提高其靈敏度，因此本試驗在乙腈-0.2%甲酸，0.05 mol·L-1磷酸溶液/三乙胺-乙腈兩種系列作為流動相的情況下測定諾氟沙星，結果發現0.05 mol·L-1磷酸溶液/三乙胺-乙腈作為流動相時，諾氟沙星出峰時間為12.377 min，且基線不穩定；0.2%甲酸-乙腈作為流動相時，諾氟沙星出峰時間為8.533 min，極大地節約了檢測時間，且響應值較高，基線穩定，鋒型更加對稱尖銳，分離效果較好，信噪比更高。具體見圖1、圖2。此外，在試驗過程中發現，熒光檢測器對于甲酸與乙腈比例的變化較為敏感，梯度洗脫時引起的基線漂移較為明顯，本文最終選擇0.2%甲酸水溶液-乙腈（87∶13）作為流動相進行等度洗脫，洗脫時間18 min。此條件溫和，不會損傷色譜柱，同時能夠有效分離得到較好峰形，易控制。

圖1 流動相為0.05 mol·L-1磷酸鹽/三乙胺-乙腈時的色譜圖

圖2 流動相為0.2%甲酸水溶液/乙腈時的色譜圖

2.1.2 流速優化

不同的色譜柱對同一樣品有不同的保留時間，同一物質其出峰時間受流速的影響極大。一般情況下，流速由色譜柱的內徑大小直接決定，內徑越大流速則相對較大，樣品分析時間也會相對較短，所以提高流速可大大縮短樣品分析時間，但樣品在色譜柱中的流速過大則會在一定程度上影響其分離效果，引起基線漂移。本試驗選擇 1.2 mL·min-1、1.5 mL·min-1、1.8 mL·min-13種不同流速，觀察流速對分離時間、基線和分離度的影響，結果見圖3、圖4和圖5。

圖3 流速為1.2 mL·min-1時的色譜圖

圖4 流速為1.5 mL·min-1時的色譜圖

圖5 流速為1.8 mL·min-1時的色譜圖

隨著流速的增加，目標物出峰時間逐漸縮短，流速為1.8 mL·min-1時，出峰時間為7.285 min，峰圖有稍微拖尾的現象，出峰前基線不穩現象明顯；當流速為1.2 mL·min-1，出峰時間為10.643 min，目標物后含有小峰；流速為1.5 mL·min-1時出峰時間為8.530 min，峰圖無拖尾現象且峰形較為尖銳對稱，相對流速為1.8 mL·min-1的譜圖，其基線更穩定，峰圖效果好，相對流速為1.2 mL·min-1的譜圖，其出峰時間有所縮短，峰圖效果好，因此本試驗研究最終選擇流速為 1.5 mL·min-1。

2.2 樣品前處理條件優化

2.2.1 方法初確定

（1）稀釋液的選擇。蜂蜜是一種特殊物質，黏稠度較大，很難均勻分散，在試驗過程中發現如果直接向蜂蜜中加入提取液乙腈，會使蜂蜜變成膠狀物。有研究表明，氫氧化鈉溶液有助于蜂蜜的溶解[17]。因此本試驗選擇水、Mallvaine pH 4.0緩沖液和0.02 mol·L-1氫氧化鈉3種稀釋液，在提取之前將蜂蜜樣品制備成均勻相體系，試驗結果發現等量添加水、Mallvaine pH 4.0緩沖液時，蜂蜜不易溶解分散，而同比例的0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液可以很好地將蜂蜜溶解使其成為分散性體系，且分離程度高，色譜圖效果好，因此選擇1.3.3中方法2進行蜂蜜稀釋液制備，即選取0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液作為蜂蜜樣品中稀釋液。

（2）提取液的選擇。選取0.05 mol·L-1L磷酸緩沖鹽溶液、0.5%乙酸的乙腈溶液、乙腈+水（8∶2）混合溶液作為蜂蜜中諾氟沙星的提取液。試驗過程中發現，同體積添加的3種提取液所提取的諾氟沙星含量分別為 0 ng·g-1、1.181 3 ng·g-1、1.151 9 ng·g-1，可見0.5%乙酸的乙腈溶液提取效果最好，因此初選取0.5%乙酸的乙腈溶液作為蜂蜜稀釋液中諾氟沙星的提取液。具體見圖6～圖9。

圖6 空白蜂蜜樣品色譜圖

圖7 磷酸鹽緩沖液為提取液時的陽性樣品色譜圖

圖8 0.5%乙酸的乙腈溶液為提取液時的陽性樣品色譜圖

圖9 乙腈+水（8∶2）混合溶液為提取液時的陽性樣品色譜圖

2.2.2 方法的進一步確定與優化

在大量的預試驗基礎上發現，樣品稀釋液的添加量和提取時加入0.5%乙酸的乙腈溶液的量對諾氟沙星的提取濃度有明顯影響，本文利用2因素3水平試驗，研究這2個因素對試驗結果的影響，結果分析如表1所示。

由表1可知，當蜂蜜∶0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液=1∶1，蜂蜜∶0.5%乙酸的乙腈溶液=1∶5時，諾氟沙星提取效果最佳，提取量為1.349 6 ng·g-1。

表1 不同添加量的氫氧化鈉和乙酸乙腈溶液對諾氟沙星提取濃度的影響（單位：ng·g-1)

2.2.3 重復性驗證

當蜂蜜∶0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液=1∶1，蜂蜜∶0.5%乙酸的乙腈溶液=1∶5時，添加不同濃度諾氟沙星，驗證蜂蜜中諾氟沙星的重復性驗證，結果分析如表2所示。選擇含3.00 ng·mL-1、8.70 ng·mL-1諾氟沙星的蜂蜜樣品，經測試精密度變異系數均不超過10%。

表2 不同添加量的諾氟沙星重復性驗證結果

2.3 方法驗證

2.3.1 標準曲線及線性范圍

將諾氟沙星標準液逐步稀釋，配制成濃度為0.001 μg·mL-1、0.002 μg·mL-1、0.004 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1和 0.200 μg·mL-1標 準 工 作 液， 以 目標峰面積為縱坐標（Y）對進樣濃度（X）進行線性擬合，得到的標準曲線方程為Y=162 611 326.87X-422 884.11，在 0.001 ～ 0.200 μg·mL-1線性關系良好，相關系數R2為0.995 7。

2.3.2 精密度與檢出限

精密吸取標液0.003 μg·mL-1，平行測定6次，得到各組分相對標準偏差為0.72%。在空白蜂蜜基質中添加0.4 μg·kg-1諾氟沙星標準溶液，諾氟沙星藥物的信噪比（S/N)大于10，表明該方法諾氟沙星藥物的方法檢出限可達到0.4 μg·kg-1，滿足分析要求。

2.3.3 加標試驗

向5 g蜂蜜空白樣中添加濃度分別為0.03 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1的 諾 氟 沙 星 標 液 各100 μL進行加標回收試驗，每個加標水平重復3次。諾氟沙星回收率結果見表3。其回收率為84.98%～105.72%，相對標準偏差為1.84%～2.94%，滿足線性分析要求。

表3 蜂蜜中添加不同濃度標樣所測回收率

2.3.4 蜂蜜產品檢測

為了將方法應用于市場，對市場上的蜂蜜樣品任選3個種類、5種不同品牌進行檢測，分別為椴樹蜂蜜、洋槐蜂蜜及老蜂蜜共抽檢了5份，均未檢出諾氟沙星，符合我國規定蜂蜜中諾氟沙星的標準值（不得檢出），差異不顯著。

3 結論

本文對市場上的蜂蜜樣品任選3個種類、5種不同品牌進行檢測，均未檢出諾氟沙星，符合我國規定蜂蜜中諾氟沙星的標準值（不得檢出），差異不顯著。以乙腈-2%甲酸水溶液（13∶87）為流動相，流速為1.5 min·L-1，柱溫35 ℃，熒光檢測激發波長280 nm，發射波長450 nm為優化后的色譜條件；以0.02 mol·L-1氫氧化鈉溶液（與蜂蜜的比例為1∶1）溶解蜂蜜，制作成蜂蜜溶液，然后用0.5%乙酸的乙腈溶液與蜂蜜水溶液（5∶1）萃取諾氟沙星，過固相萃取柱氮氣吹干，再以乙腈溶解為優化后的前處理方法，采用高效液相色譜法-熒光檢測器檢測蜂蜜中的諾氟沙星藥物殘留量。結果表明，該方法的檢出 限 為 0.4 μg·kg-1， 在 0.001 ～ 0.200 μg·mL-1呈 良好的線性關系，相關系數R2=0.995 7，加標回收率為84.98%～105.72%，利用該方法通過檢測不同品牌生產的蜂蜜，結果均未檢出諾氟沙星，進一步驗證本方法能夠滿足殘留分析的要求，為蜂蜜中諾氟沙星殘留量測定提供了一種簡便快捷準確的色譜方法，為蜂產業的安全生產提供了保障。