不同品種鴨胚胎期脂肪酸合成差異性研究

文│李卿青 周彥（四川省達州市達川區畜牧發展服務中心）

甘偉（四川省達州市農業科學研究院）

文│劉芳 馬東* 馮波 高田田 劉旺（陜西省榆林市羊產業發展中心）

胚胎期各物種的脂肪合成部位不同，哺乳動物主要在脂肪組織合成，禽類則在肝中合成。禽類胚胎期脂肪組織的發育取決于血漿甘油三酯（TG）的活性，TG主要來源于肝，通過脂蛋白將合成的脂肪酸輸出到肝外組織，為機體提供能量。同時，肝的脂肪合成還可直接促進脂肪組織原位脂肪沉積和長期能量儲存。

胚胎期被認為是動物生長發育最重要、最敏感的時期之一，它直接決定了動物未來的生長發育。研究表明，在卵裂早期增加葡萄糖和氧氣消耗可以改變卵裂晚期的代謝活性。

在胚胎發育過程中，人們對不同品種雞的肝脂肪生成情況進行了研究，但不同鴨品種間是否存在差異還未有報道。本研究選擇北京鴨、建昌鴨、黑鶩鴨3個鴨品種的20日齡（E20）和28日齡（E28）胚胎為樣本，通過檢測血漿中總膽固醇（TC）、TG、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量和肝中乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸延長酶（ELOVL）、脂肪酸合成酶（FAS）表達量來探索不同品種鴨胚胎期脂肪酸合成的差異性。

一、材料與方法

1.試驗動物與試驗設計。試驗選取北京鴨、建昌鴨和黑鶩鴨3個品種，每個品種選取20個鴨受精蛋進行孵化，在孵化的第20、28天，每個品種分別隨機選出10個試驗蛋采集胚胎肝組織樣本，-80℃下冷凍保存。從試驗蛋大側的毛細血管網絡中采集血液，血清經4℃3000轉/分鐘離心10分鐘，-20℃保存。

2.酶活指標檢測。TC測定試劑盒、TG測定試劑盒、ACC測定試劑盒、ELOVL測定試劑盒、FAS測定試劑盒均來自中國四川制造生物技術公司，HDL-ELISA試劑盒來自中國上海邦毅，LDL-ELISA試劑盒來自中國邁瑞生物。試驗操作按照各試劑盒說明書進行。

3.RNA分離及cDNA合成。從-80℃冰箱中取出凍存組織，在液氮中研磨成粉，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。將提好的RNA于1.5%瓊脂糖凝膠中檢測其完整性，并在紫外分光光度計260/280納米波長處檢測純度和濃度。取部分檢測合格的RNA，反轉錄第一鏈cDNA（具體步驟參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書），將產物稀釋后保存在-20℃冰箱中備用。

◎圖1 血脂因子TC、TG、HDL-C、LDL-C酶活性

4.基因表達測定。實時熒光定量在BIO-RAD CFX system熒光定量PCR儀上進行，反應體系：2×SYBR premix Ex TaqTM 6.25微升，cDNA 1微升，10微米上下游引物各0.25微升，ddH2O 4.75微升。反應程序為：95℃預變性3分鐘；95℃變性10秒，64℃ 退火30秒，95℃延伸10秒，40個循環，每個試驗重復3次，并以不加模版的cDNA為陰性對照?；虻奶禺愋砸锶绫?所示，β-actin和GAPDH-rRNA作為內參基因。所有的反應一式三份，數據代表3個獨立試驗的平均值。目的基因mRNA相對表達量采用2-ΔΔCT方法，根據基因PCR反應的Ct值進行計算，計算結果使用內參基因進行標準化校正。

表1 定量PCR引物

5.統計分析。試驗數據使用SPSS 20進行單因素方差分析，采用Duncan’s法進行多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，其中P＜0.05表示組間差異顯著，P＜0.01表示組間差異極顯著。

二、試驗結果

1.3個鴨品種E20和E28期間血脂因子TC、TG、HDL-C、LDL-C酶活性。血脂水平的高低反映了鴨的脂肪酸合成能力，由圖1可知，E20和E28兩個階段，不同品種間血脂因子表達量無顯著差異。E20時期，3個品種的各血脂因子表達量由多到少依次是TC、TG、LDL-C、HDL-C，E28時期，3個品種的各血脂因子表達量由多到少依次是TC、LDL-C、TG、HDL-C。

2.3個鴨品種E20和E28期間肝組織中ACC、ELOVL、FAS mRNA表達量。由圖2可知，E20時期北京鴨3個基因均極顯著高于建昌鴨和黑鶩鴨（P＜0.01），同時，建昌鴨極顯著高于黑鶩鴨（P＜0.01）。E28時期，北京鴨的ACC、ELOVL、FAS表達量均顯著低于建昌鴨（P＜0.05），黑鶩鴨ELOVL表達量顯著高于北京鴨（P＜0.05），建昌鴨FAS表達明顯高于黑鶩鴨（P＜0.01）。

3.3個鴨品種E20和E28期間肝組織中ACC、ELOVL、FAS酶活性。由圖3可知，E20時期，ACC在3個品種間無顯著差異，ELOVL的表達量建昌鴨和黑鶩鴨顯著高于北京鴨（P＜0.05），FAS僅北京鴨顯著高于建昌鴨（P＜0.05）。E28時期，ELOVL的表達量在3個品種間無顯著差異，建昌鴨的ACC顯著高于黑鶩鴨（P＜0.05），北京鴨的FAS顯著高于建昌鴨（P＜0.05）。

三、討論

◎圖2 肝脂肪合成關聯基因mRNA表達水平

肝產生的脂質包括甘油三酯、膽固醇和磷脂，甘油三酯通過血漿極低密度脂蛋白轉運到肝外脂肪組織，膽固醇通過與HDL-C或LDL-C結合，在血清中循環。ACC、ELOVL和FAS是肝脂肪合成過程中的關鍵酶，ACC為限速酶，可催化乙酰輔酶A的羧基化，ELOVL將短鏈脂肪酸轉化為長鏈脂肪酸以儲存能量，FAS催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A的縮合，通過復雜的七步反應合成長鏈脂肪酸。因此，我們可以通過上述參數來探討肝中脂肪合成量。

◎圖3 肝脂肪合成關聯基因酶活性

本研究表明，TC含量高于TG，提示胚胎期膽固醇是主要脂肪酸。3種鴨的TC、TG、HDL-C、LDL-C差異無顯著性（P＞0.05）。但在其他研究中，品種間TC含量存在差異，如7個自交系雞蛋黃膽固醇含量差異顯著。這些研究大多在卵模型中進行，至今還沒有直接研究胚胎期不同品種血漿膽固醇含量。E28的TG含量明顯低于E20，可能是由于蛋殼破裂當天TG急劇消耗所致，HDL-C的情況相反，這一趨勢可能提示E28階段HDL轉運到肝外的膽固醇多轉化為膽汁。E20階段北京鴨ACC、ELOVL、FAS基因表達明顯高于建昌鴨和黑鶩鴨，這些結果與脂肪型雞ACC基因表達高于胚胎中的瘦肉型雞結果一致。

以上結果表明，3個鴨品種在胚胎期肝新生脂肪生成（DNL）過程中沒有顯著差異。以往試驗數據表明，北京鴨皮下脂肪和腹部脂肪含量高于建昌鴨和黑鶩鴨。其原因可能是，一方面，DNL的容量受年齡影響。丁芳研究表明，北京鴨肝中，脂質基因表達在第4周或第5周達到高峰，然后隨機體生長而下降，這與其他報告的結果一致，即鳥類脂肪細胞的DNL容量主要取決于年齡。另一方面，脂肪酸/甘油三酯的來源有4種：新脂肪發生、細胞質甘油三酯儲存、直接吸收肝脂蛋白殘基甘油三酯衍生脂肪酸和脂肪組織釋放的血漿非酯化脂肪酸，因此，鴨胚胎期脂肪發生的主要方式還有待進一步研究。

四、結論

綜上所述，3種鴨胚胎期DNL過程存在顯著差異，但血清中最終脂肪酸含量無明顯差異。這可能是DNL不是脂肪酸合成的惟一決定因素。本研究首次開展了不同品種鴨胚胎期DNL的研究，從一個角度揭示了不同品種鴨品種間的脂肪形成狀況，為今后肝脂肪合成提供了一定的理論參考。