Caco-2單層細胞模型在中藥化學成分吸收轉運研究中的應用

于連婷，矯艷磊，于美娜，雷玉敏，馬瑩慧

(吉林醫藥學院，吉林 吉林 132013)

將來源于人體結腸癌細胞的Caco-2細胞培養于多孔可滲透聚碳酸酯膜上，在培養過程中經歷分化過程，可形成在形態和功能上都類似于人體小腸上皮細胞的連續緊密的單層，這就是Caco-2單層細胞模型[1]。中藥主要經口服給藥的方式進入人體，在經過小腸上皮細胞時被吸收轉運進入人體進而發揮出相應的藥效。因此，我們可以通過建立并評價Caco-2單層細胞模型，用來模擬人體小腸對中藥當中某些化學成分的吸收轉運過程，從而研究這些化學成分的轉運機制、生物利用度以及不同化學成分之間的相互影響，對研究中藥能否發揮藥效以及不同藥物之間相互作用非常重要[2-3]。本文對Caco-2單層細胞模型在中藥化學成分吸收轉運研究中的應用進行綜述。

1 Caco-2單層細胞模型概述

Caco-2單個細胞呈現出扁平狀或多角形，連成膜狀貼壁生長。將細胞接種于培養瓶一段時間后，細胞會進行形態學上的分化，細胞邊緣側呈刷狀緣，并且細胞與細胞之間無縫連接形成緊密的細胞單層，當細胞之間緊密連接融合后，細胞的數量即到達高峰[4]。在接種細胞幾天后，細胞開始進行分化，這時候，細胞可分化為AP側和Bl側。具體來說，AP側(apical)又叫腸腔側，含有小腸微絨毛水解酶以及載體；BL側(basolateral)又叫腸內壁側，當AP側堿性磷酸酶高于BL側的時候就會產生極化現象[5]。一般來說，Caco-2單層細胞模型的通透性、完整性、極化程度是判斷其是否符合各項指標的主要條件[6]。研究表明，在Caco-2細胞中同時存在氨肽酶等與生物體內物質代謝相關重要酶類[7]。Caco-2細胞在培養方面具有方法簡單、成本低等優點，可以用來模仿人體小腸環境，研究藥物經過人體小腸的吸收轉運過程和具體的轉運機制。另外，對于口服藥物的前體藥物，還可以利用該模型評價安全性等。但是，Caco-2細胞同時也具有培養周期較長、模型建立是否成功的評價標準不易確定等缺點[8-10]。

2 Caco-2單層細胞模型在中藥化學成分吸收轉運研究中的應用

人體的給藥途徑包括皮膚給藥、舌下給藥、直腸給藥以及口服給藥等，其中口服給藥是最常用也是最方便的一種給藥方式。在口服給藥過程中，腸道是藥物的必經之路。將來源于人類結腸癌系細胞株的Caco-2細胞在某種特定的條件下進行培養，通過分化與極化形成功能，建立成一種在形態、滲透性、功能特征等都與人體小腸上皮細胞極為相似的單層細胞模型，并且藥物通過該模型的體外吸收過程與藥物在人體體內的腸道吸收過程具有良好的相關性。因此，可以將Caco-2單層細胞模型作為一種研究藥物在人體小腸吸收及轉運機制的工具，通過模擬小腸上皮細胞的形態和功能來研究藥物的吸收轉運過程[9-12]。在建立好Caco-2單層細胞模型后，對藥物從AP側轉運到基底面BL側，或從BL側轉運到AP側進行研究，再利用液質聯用的方法對細胞液樣品進行定量分析，明確藥物的吸收轉運過程，繼而研究其轉運機制、影響因素、代謝情況以及藥物之間相互作用。

2.1 轉運過程中影響因素的研究

大量試驗表明，可利用Caco-2單層細胞模型來研究藥液pH值、濃度、時間等因素對藥物吸收轉運的影響[13]。李松林等為探究不同結構類別的黃酮類化合物的吸收與其結構的關系，通過建立Caco-2單層細胞模型，分別研究了多種類黃酮化合物通過細胞模型的吸收過程。選取了pH從5.0到8.0七個不同值來探究Caco-2細胞對不同黃酮類藥物的吸收性，發現當pH從小增大時，黃酮類藥物的吸收度越來越小，其中槲皮素的吸收度變化最大。接下來選取pH為7.4來考察不同藥物濃度對吸收度的影響。結果表明，幾種不同的黃酮類藥物經Caco-2細胞的吸收量與藥物濃度均呈線性關系[14]。

2.2 藥物轉運機制的研究

藥物在腸道中的轉運機制可分為被動轉運和主動轉運以及膜動轉運三種。首先是被動轉運，當發生被動轉運時往往是物質從濃度高的一側向濃度低的一側轉運，這個過程并不需要載體；而主動轉運則與被動轉運相反，當發生主動轉運時，物質是從濃度較低的一側至濃度高的一側，并且需要能量與載體。在探究藥物在人體腸道轉運時究竟是何種機制時，Caco-2單層細胞模型成為主要的考察手段[15]。

2.3 藥物代謝及吸收轉運與構效關系的研究

研究發現，人體小腸中存在豐富的代謝酶，部分口服藥物在經過胃腸道上皮過程中可被代謝。而在體外建立的Caco-2單層細胞模型經過檢測發現存在著與人體小腸中相同的細胞色素P450同工酶，因此該模型可被應用于口服藥物的代謝研究中。近年來，Caco-2細胞模型還在藥物代謝的相關研究中取得了很多成就。例如劉東等對Caco-2單層細胞模羧酸酯酶的代謝特征進行研究，證明Caco-2細胞表達人類羧酸酯酶1較高，表達人類羧酸酯酶2較少[16]。葛月賓等應用Caco-2單層細胞模型對大豆苷元溶液進行轉運試驗，在A側、B側、分子細胞膜中檢測到了少量的代謝產物，證明大豆苷元藥物在人體腸部具有良好的吸收性[17]。

2.4 藥物的毒性研究

劉志偉等為探究銅對人體的毒性，建立了Caco-2單層細胞模型。培養Caco-2細胞后加入不同濃度的銅離子并采用MTT法測定了細胞活力，發現銅暴露濃度在超過20 μmol/L時顯著降低細胞活力；采用P糖蛋白活性檢測試驗來判斷Caco-2細胞的耐藥性，發現銅暴露的濃度越高，暴露的時間越長，糖蛋白活性越低；采用細菌入侵試驗測定銅對細菌入侵Caco-2細胞及其在細胞內存活率的影響，結果發現銅會顯著增加細菌入侵Caco-2細胞的數量，細胞經銅暴露30 min后，存活細胞的CFU值由400左右降到300左右，而24 h后，細菌在細胞中的存活數量又發生減少[18]。

2.5 中藥化學成分之間相互作用研究

臨床上所應用的中藥復方或者中藥制劑通常為幾種中藥或藥物中幾種有效成分組成的聯合制劑，多種成分在經體內小腸吸收時可能會存在協同或拮抗的作用，主要原因可能是這些藥物或有效成分存在競爭酶或載體的問題。在研究藥物相互作用的關系和機制過程中也可應用Caco-2單層細胞模型模擬人體小腸。例如廖正根等探究了桂枝茯苓膠囊中幾種有效成分在小腸上皮細胞中的吸收特點，結果顯示，單度藥物中提取出來的成分，例如桂枝桃仁提取物中的苦杏仁苷，白芍、牡丹皮提取物中的芍藥苷，它們的吸收參數明顯低于中藥復方桂枝茯苓中這二者的吸收參數,表明該復方當中幾種中藥的配伍可能促進某些藥用活性成分的吸收，從而使其更好地發揮藥效[19]。另外有研究表明，小檗堿與黃連堿具有協同作用；細胞色素P4503A4和P糖蛋白具有協同作用；白芷有效成分對阿魏酸的轉運具有促進作用；胡皂苷a和d對腸道吸收芍藥苷具有促進作用[20]。

近年來，因Caco-2單層細胞模型與人體小腸具有良好的相關性，利用Caco-2單層細胞模型來研究中藥當中化學成分的吸收、代謝、轉運過程、轉運機制和相互作用關系得到了越來越多學者的認可。另外，Caco-2單層細胞模型也可用于藥物的高通量篩選，在預測藥物在人體內的轉運機制、評價藥物應用的安全性、為藥物的劑型設計提供實驗依據等方面發揮重要的作用。隨著對其不斷地深入研究，Caco-2單層細胞模型在中藥化學成分吸收轉運研究領域，將具有越來越廣泛的應用前景，并且其在食品領域也將被越來越多地應用[21-22]。但是，由于Caco-2單層細胞模型還存在著一些不足之處，因此需對其進行更多的試驗與研究，使其更好地應用于相應領域，以發揮更大的作用。