生物鐘基因在卵巢癌中的研究進展

俞元瑛，崔李寧

卵巢癌發病率在女性生殖系統腫瘤中位居第三，根據最新流行病學統計，2020年全球新發卵巢癌313 959例，其中死亡207 252例[1]，死亡率位居婦科惡性腫瘤之首。因缺乏有效、特定的篩查方法和能夠早期診斷的方法，絕大多數卵巢癌患者在確診時已為晚期，存在局部或遠處轉移，其5年生存率約為46%[2]。在治療過程中，卵巢癌患者死亡的最主要原因為腫瘤復發和瘤體轉移[3]。目前，對于卵巢癌的發病和轉移機制尚不完全清楚，因此，探尋卵巢癌的發病和轉移機制對其篩查、早期診斷及后續治療意義重大。哺乳動物的活動具有晝夜節律，晝夜節律由生物鐘控制，對生物鐘而言，生物鐘基因是其分子基礎[4]。女性卵巢的生殖周期受晝夜節律的影響，本文就近些年生物鐘、生物鐘基因與卵巢癌的研究進展予以綜述，并對今后的研究作出展望。

1 晝夜節律與生物鐘及生物鐘基因

在哺乳動物中，晝夜節律是機體內的一種生理現象，大約24 h為周期，使機體的生理過程與外界環境的變化相協調，是適應環境的一種表現，涉及機體多系統功能調控。

晝夜節律的產生和維持依賴于中樞及外周兩個生物鐘系統。哺乳動物的中樞生物鐘位于視交叉上核（SCN）[5]，白天光信號通過視網膜下丘腦束傳入，夜間松果體分泌出褪黑素進行反饋，以此調控晝夜節律[6]。外周生物鐘則存在于全身大多數外周組織中，不僅可以被中樞生物鐘調控，接受SCN的神經、體液或其他信號因子調控，也可自主運行，自行調控基因表達，這些基因表達與各組織特異性的功能相關[7]。兩者共同作用，協調哺乳動物的生理活動，使之隨晝夜交替，從而呈現節律性變化。

生物鐘基因為生物鐘產生、維持晝夜節律的分子基礎[4,8]。目前研究發現，有十多個生物鐘基因形成生物鐘調控系統的負反饋轉錄翻譯環路，包括Bmal1、Clock、Per、Cry、Ror、Rev-Erb、Tef、Dbp及Hlf等。Bmal1基因編碼的蛋白質與Clock基因編碼的蛋白質結合，可形成Bmal1/Clock異二聚體。白天時，轉錄因子Bmal1/Clock異二聚體進入細胞核內，結合到生物鐘基因Per和Cry上游啟動子的E-box元件，激活其轉錄。激活后，Per、Cry不斷地被轉錄和翻譯，于是在細胞質中，Per蛋白、Cry蛋白不斷地生成、積累，同時與AMP活化蛋白激酶（AMPK）和酪蛋白激酶I（CKI和CKI）相互作用。夜晚時，Per與Cry復合物轉移至細胞核內，在細胞核內與Dbox元件相結合，而D-box元件則位于Bmal1和Clock的啟動子區域。該結合物不僅抑制Bmal1、Clock轉錄，還有負性調節功能。而后，Per蛋白、Cry蛋白在CKI、CKI的催化下，發生磷酸化和泛素化修飾反應而被進一步降解，隨著Per蛋白和Cry蛋白降解，其抑制作用也隨之消失。抑制作用消失后，Bmal1/Clock異二聚體便可再次表達，開始新的轉錄循環[9-10]。與此同時，核受體基因Ror/、Rev-Erb/啟動子上的E-box元件，可與Bmal1/Clock異二聚體結合，隨后促進Ror/、Rev-Erb/轉錄，生物鐘基因轉錄翻譯震蕩機制的輔助環路由此啟動。而Ror/、Rev-Erb/轉錄翻譯的Ror/蛋白、Rev-Erb/蛋白，與Bmal1啟動子區的受體應答元件可競爭性結合。在Bmal1的轉錄過程中，Ror/蛋白起促進作用，而Rev-Erb/蛋白起抑制作用。因此，Ror/和Rev-Erb/轉錄翻譯的Ror/蛋白和Rev-Erb/蛋白，對生物鐘主環路存在另一種調控作用[11]。

除了Bmal1、Clock、Per、Cry、Rev-Erb、Ror等這些目前研究較多的核心生物鐘基因之外，還有一些鐘控基因組成了另外的轉錄調控環路，比如E4bp4、Dbp、Hlf等轉錄因子家族。E4bp4基因是Rev-Erbs的靶基因，Dbp基因是Bmal1/Clock異二聚體的靶基因，兩者可在細胞核內與Dbox元件結合，對Per基因表達進行調控[12]。Hlf基因有明顯的節律性，可作為生物鐘的輸出調節劑，有抑制細胞死亡的作用[13]。

2 生物鐘與卵巢

卵巢是女性產生、排出卵子并分泌甾體激素的性器官。目前研究表明，卵巢細胞中的生物鐘在卵巢生理過程中發揮重要作用。卵巢的生殖周期受晝夜節律的影響，其節律性接受神經和內分泌組織的協調及同步活動。這種協調是由下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸各層面的基因表達和細胞生理學促進的。有研究報道在HPO軸的各組織中均已觀察到生物鐘基因的表達[14]，各層次的生物鐘相互協調和同步，維持正常的生殖行為。晝夜節律的產生、維持和調控依賴連鎖的轉錄-翻譯反饋環路（TTFL），其決定著HPO軸每個組織中基因表達的周期和振幅。卵巢的生物鐘接受SCN的神經內分泌調控，同時又具有自主性。

SCN能產生精氨酸加壓素（AVP）和血管活性腸肽（VIP）。AVP信號對于GnRH神經元網絡的視交叉上核調節同樣至關重要。AVP受Bmal1/Clock復合物的調節,并以雌激素依賴的方式刺激Kisspeptin神經元[15]，Kisspeptin神經元接受刺激后分泌Kisspeptin多肽。Kisspeptin多肽在生殖中的主要作用是刺激促性腺激素釋放激素（GnRH）神經元，該神經元則將GnRH釋放到垂體-門脈系統中，GnRH促進垂體釋放促卵泡激素和黃體生成素，兩者進入血液，作用于卵巢，以促進接下來的生理活動[16]。VIP則可刺激GnRH神經元活動。HPO軸上各種生物鐘相互協調和同步以促進正常生殖行為。

3 生物鐘基因與卵巢癌的發生發展

相關研究顯示，許多健康問題的發生率與生物鐘的改變和破壞直接相關[17]，也有研究認為生物鐘受到破壞引起的疾病，是由生物鐘基因劑量變化和連鎖的轉錄-翻譯反饋環路中的基因劑量失去控制所致[18]。

卵巢腫瘤可發生于任何年齡，為常見的婦科腫瘤。其中惡性卵巢腫瘤早期病變不易被發現，晚期時缺乏有效的治療手段，為婦科惡性腫瘤中致死率最高的疾病。卵巢的生物鐘被打亂，或與其他部位生物鐘的晝夜節律不同步，會導致各種生殖疾病的發生和發展，其中包括卵巢癌。

3.1 Bmal1基因與卵巢癌 Bmal1基因，也稱作Arntl基因，在分子水平，是哺乳動物晝夜節律震蕩器中的關鍵元件之一。它編碼蛋白質Bmal1，位于11號染色體短臂，通過自身的表達調控、正負反饋通路和其他機制產生晝夜節律性。Bmal1基因不僅表達于所有視交叉上核細胞，在多數外周細胞中也存在表達[19]。

Bmal1基因編碼的Bmal1蛋白通過與Clock基因編碼的Clock蛋白結合后，形成Bmal1/Clock異二聚體，與Per、Cry等基因形成一個轉錄-翻譯負反饋循環，在此反饋循環中Bmal1基因起到核心調控作用。在分子水平上，Bmal1基因參與腫瘤的發生，不僅表現在其發生異常之后導致正常細胞的細胞分裂、細胞周期和細胞凋亡異常，為細胞的惡變創造條件；還表現在該基因影響細胞侵襲性、腫瘤分期，與腫瘤進展密切相關。

在消化道、頭頸、血液系統等腫瘤中，Bmal1基因是抑癌基因。有研究發現，沉默Bmal1基因會令癌細胞加速增殖。因為抑制Bmal1基因表達后，抑癌基因p53的表達隨之受到抑制。p53基因表達受抑制，使細胞周期蛋白B1、D1和E合成受到促進，從而導致DNA損傷降低，細胞的凋亡減少，腫瘤細胞的增殖因此受促。實驗表明，Bmal1過表達可抑制癌細胞增殖[20-21]。Jung等[22]通過實驗發現，Bmal1基因可通過拮抗致癌基因Bclw、抑制PI3K-Akt-MMP-2信號通路，降低腦膠質瘤的侵襲性。同時Rana等[23]發現，Bmal1缺失后，轉錄下游與細胞增殖、凋亡相關的靶基因可缺失，慢性淋巴細胞白血病發病機制或與此相關。

在卵巢癌中，Bmal1基因起到抑制作用。Bmal1基因表達受抑后，p53的表達受到抑制，細胞周期蛋白D1合成增加，DNA損傷降低，細胞凋亡減少，腫瘤細胞便增殖。細胞周期蛋白D1是一種與細胞周期蛋白依賴性激酶4選擇性相關的調節激酶亞單位，是細胞周期G1進展的關鍵調節因子[24]。有研究發現在卵巢癌患者中，細胞周期蛋白D1過表達，卵巢腫瘤中細胞周期蛋白D1的擴增很少發生[25]。因此，Bmal1基因過表達，對卵巢癌細胞增殖起到抑制作用。

3.2 Clock基因與卵巢癌 Clock基因在分子水平，也是哺乳動物晝夜節律震蕩器中的關鍵元件之一。它編碼蛋白質Clock，位于4號染色體長臂，通過自身的表達調控、正負反饋通路和其他機制產生晝夜節律性。Clock基因在下丘腦視交叉上核表達。

Clock基因編碼的Clock蛋白通過與Bmal1基因編碼的Bmal1蛋白結合形成Bmal1/Clock異二聚體，與Per、Cry等基因形成一個轉錄-翻譯負反饋循環，在此反饋循環中Clock基因同Bmal1基因一樣，有核心調控作用。此外，Matsuo等[26]通過研究發現，Clock能激活WEEL的啟動子，使細胞分裂周期基因2磷酸化，導致其失活，抑制細胞G2/M期過渡，以此調控細胞周期。

Xu等[27]通過實驗檢測順鉑敏感A2780和順鉑耐藥CP70細胞中Clock mRNA和蛋白的表達，發現與順鉑敏感的A2780細胞比較，后者Clock mRNA和蛋白表達均增加。而在敲除后者的Clock基因后，順鉑能夠使細胞增殖受抑制，誘導細胞凋亡。該實驗表明，Clock基因在癌細胞中的表達與順鉑耐藥性有關。卵巢癌細胞中Clock基因的上調，可導致其對順鉑治療的敏感性降低。

3.3 Per基因與卵巢癌 Per基因同為重要組成部分，有Per1、Per2、Per3等亞型，分別編碼蛋白質Per1、Per2、Per3等，位于17號染色體短臂。實驗發現，與正常組織相比，晝夜節律紊亂的卵巢癌患者腫瘤樣本中，生物鐘基因Per轉錄的Per1、Per2蛋白表達顯著降低[28]。Per1、Per2蛋白對轉錄因子Bmal1/Clock異二聚體生成起負性調節作用，同時也抑制Bmal1基因和Clock基因轉錄[10]。

同時，Per1在不同的癌組織中存在差異表達，在各種卵巢癌中，Per1的表達均低于正常卵巢組織。根據統計，Per1基因低表達的卵巢癌患者，總體生存率低下。在I期和II期卵巢癌患者中，Per1表達降低與預后不良相關，而在III期和IV期患者中，Per1表達升高和p53突變與總體生存率和無進展生存率差相關。在卵巢癌患者中，Per1表達水平與包括中性粒細胞、調節性T細胞和M2巨噬細胞在內的細胞浸潤水平呈正相關，并與多種免疫標記物密切相關。Per1表達降低與總體生存率低顯著相關[29]。

有研究發現，Per2表達與卵巢上皮性腫瘤關系密切，隨著腫瘤惡性期別升高，Per2基因表達逐漸減少或缺失。腫瘤組織的缺氧條件，可通過降解Per2引起上皮間質轉化基因激活，使腫瘤出現高侵襲力。Per2可能是通過下調bcl-2基因，該基因是一種腫瘤凋亡抑制基因，從而促進凋亡基因bax表達，促使腫瘤細胞凋亡，進而抑制卵巢癌生長、轉移，發揮抑瘤作用[30]。他們的實驗還發現，Per2在局部持續高表達，可降低卵巢癌腫瘤組織中VEGF/VP表達，降低微血管的密度，說明其可能通過抑制血管新生來抑制腫瘤細胞的轉移。Per2還可導致MMP-9和MTA-1表達顯著降低，MMP-9和MTA-1與腫瘤侵襲性高度相關，進而抑制腫瘤浸潤轉移。在卵巢癌的移植瘤中，Per2基因過表達可降低PI3K/Akt通路蛋白表達，該信號通路的激活刺激腫瘤血管形成，細胞惡性增殖，促進腫瘤的發生和發展。由此推測，Per2基因通過抑制PI3K/Akt信號通路，凋亡異常細胞，進而抑制卵巢癌生長、轉移，發揮抑瘤作用[31]。

4 生物鐘基因與卵巢癌的診療

研究Bmal1、Clock、Per等生物鐘基因表達與卵巢癌病理學指標等臨床特征相關性，能夠豐富腫瘤發生發展機制，為臨床的卵巢癌預防、診斷提供新的思路。腫瘤時辰治療是以人體正常的晝夜節律、不同時間腫瘤細胞的生長特性的差異為依據，將治療方案個體化，從而降低藥物毒性，提高治療效果的一種治療方式。腫瘤時辰化療不僅已有所應用，且療效甚佳。Levi等[32]發現，在相對應的時間對患者予抗腫瘤藥物治療，與錯誤時間給藥或持續給藥相比，根據時辰治療的要求給藥時，藥物毒性反應可減少5倍。

相信隨著對Bmal1、Clock、Per等生物鐘基因的研究逐漸深入，根據晝夜節律制定卵巢癌患者的個體化治療方案指日可待，對生物鐘基因的研究將極大地提高腫瘤治療效果，降低藥物的不良反應。

5 展望與未來

不同的生物鐘基因在卵巢癌中的作用各不相同，盡早明確各個生物鐘基因的作用機制與卵巢癌的關系，不僅能幫助臨床醫生及時發現早期卵巢癌患者，還能指導臨床優化卵巢惡性腫瘤患者的個體化治療方案。