人參皂苷Re-β-環糊精包合物的制備及其體內藥動學研究

章國磊， 姜星宇， 王 偉， 陸勃帆， 李世男， 焦麗麗， 李 慧*， 吳 巍*

(1.長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117；2.長春金賽藥業有限責任公司，吉林 長春 130012)

人參皂苷Re是人參三醇型皂苷的主要成員[1]，具有提高記憶力[2]、促進脂質代謝[3]、改善心血管[4]、抗衰老[5]、抗疲勞[6]等藥理活性。但該成分溶解度較差，生物利用度很低，導致其臨床應用受限[7]。

近年來，環糊精包合技術在提高疏水性藥物溶解性、化學穩定性、生物利用度方面取得了較好效果[8-9]，其中β-環糊精作為難溶性藥物分子的包合材料，因其低生物毒性、高生物相容性而備受關注[10-13]，但尚無應用于包合人參皂苷Re的報道。因此，本實驗制備人參皂苷Re-β-環糊精包合物，并考察其體內藥動學，以期為改善該成分吸收、增加其臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo公司)；TA-Q20差示量熱掃描儀(美國TA公司)；TD3500 X射線衍射儀(丹東通達科技有限公司)；JSM-IT100掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)；HAC-I自動氮吹濃縮儀(天津市恒奧科技發展有限公司)；Ultimate3000型液相色譜系統、TSQ Endura三重四極桿質譜儀(美國Thermo公司)；AG 22331低溫高速離心機(德國Eppendorf 公司)；SQP電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]。

1.2 試劑與藥物 對照品人參皂苷Re(批號B10M8S35243，上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)、人參皂苷Rf(批號52286-58-5，上海寶曼生物科技有限公司，純度≥98%)。β-環糊精(批號C10575901，上海麥克林生化科技有限公司，純度>98%)。甲酸、乙腈為色譜純(美國Thermo Fisher Scientific公司)；其他試劑均為分析純；水為雙蒸水。

1.3 動物 SD大鼠，雄性，體質量200～220 g，購自中國長春億斯實驗動物技術有限公司，許可證號XS191227014037，動物福利和實驗由長春中醫藥大學動物保健與使用委員會批準。

2 方法與結果

2.1 相溶解度測定 基于Higuchi、Connors[14]報道的方法，將過量人參皂苷Re加到2 mL不同濃度(0～30 mmol/L)β-環糊精溶液中攪拌混勻，充入氮氣后密封以防止藥物氧化，將混懸液在25 ℃下攪拌168 h，達到平衡后4 000 r/min離心10 min，除去多余的人參皂苷Re，濾液過0.22 μm微孔濾膜，適當稀釋后采用HPLC法[15]測定人參皂苷Re含量。以β-環糊精濃度為橫坐標(X)，人參皂苷Re在不同濃度β-環糊精溶液中的溶解度為縱坐標(Y)繪制相溶解度曲線，計算表觀穩定常數(Ks)，公式為Ks=Slope/S0(1-Slope)，其中Slope為曲線斜率，S0為在沒有β-環糊精時人參皂苷Re溶解度。其他熱力學參數可通過溫度和穩定常數計算得到，如吉布斯自由能(ΔG)，公式為ΔG=-RTlnKs，其中R為通用氣體常數[8.314 J/(mol·K)]，T為開爾文溫度。

結果，相溶解度曲線為Y=0.002 7X+0.105 4(R2=0.997 0)，表明人參皂苷Re溶解度隨著β-環糊精濃度增加而線性升高，根據相溶解度圖分類方法，可將其歸為AL型，即包合物是由人參皂苷Re與β-環糊精按1∶1比例結合所得。另外，S0(×10-3mol/L)為0.403，Slope為0.189，Ks(×10-3mol/L)為0.631，ΔG為-16.837 5 kJ/mol<0，表明包合在常溫常壓下溶液中可能是自發進行的。

2.2 包合物、物理混合物制備

2.2.1 包合物 按1∶1比例精密稱取β-環糊精、人參皂苷Re適量，將前者置于磨口錐形瓶中，加入150倍量水，水浴加熱攪拌使其充分溶解；后者加入適量無水乙醇使其完全溶解，緩慢滴加至前者溶液中，在30 ℃下攪拌4 h，60 ℃旋轉蒸發除去溶劑，濾液在-80 ℃下冷凍12 h，置于凍干機中冷凍至完全干燥，即得(性狀為白色固體粉末)。

2.2.2 物理混合物 按1∶1比例精密稱取β-環糊精、人參皂苷Re適量，攪拌混勻，即得。

2.3 溶解度測定 精密稱取過量人參皂苷Re及其β-環糊精包合物，置于10 mL棕色量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，制成過飽和溶液，35 ℃、100 r/min離心，微孔濾膜過濾，取續濾液，HPLC法[15]測定人參皂苷Re含量，計算溶解度。結果，人參皂苷Re及其β-環糊精包合物的溶解度分別為0.35、3.54 mg/mL，后者是前者的10.11倍。

2.4 溶出度測定 精密稱取原料藥、物理混合物、β-環糊精包合物各6份(均含20 mg人參皂苷Re)，置于(37±0.5)℃恒溫的200 mL去離子水中，設定轉速為100 r/min。采用轉籃法，當藥物接觸到介質時于5、15、30、45、60 min用取樣針各取樣1.0 mL，同時補加1.0 mL同溫介質，0.22 μm水系微孔濾膜過濾，在203 nm波長處測定吸光度[15]，計算累積溶出度，繪制溶出曲線，結果見圖1。由此可知，原料藥溶出非常緩慢，60 min內累積溶出度仍小于20%；物理混合物累積溶出度略高于原料藥；β-環糊精包合物溶出非常迅速，這可能是由于β-環糊精可顯著減少人參皂苷Re與溶解介質之間的界面張力，從而提高前者溶出度和溶解度，并且在一定程度上也能改善其口服生物利用度[16-17]。

2.5 表征研究

2.5.1 傅立葉紅外光譜(FT-IR) 取原料藥、β-環糊精、物理混合物、β-環糊精包合物適量，與KBr混合研磨均勻后壓片，采用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1波數范圍內進行分析，結果見圖2。由此可知，原料藥紅外譜圖中3 427.1 cm-1附近為-OH的伸縮振動峰，2 932.3、2 872.3 cm-1附近分別為-CH3、-CH2的伸縮振動峰，1 650.3 cm-1附近為-OH的彎曲振動峰，1 029.3 cm-1附近為C-O的伸縮振動峰；物理混合物紅外譜圖可看成是β-環糊精、人參皂苷Re紅外譜圖的疊加，-CH2的伸縮振動峰仍存在；β-環糊精包合物紅外譜圖中上述特征峰消失，與β-環糊精紅外譜圖非常接近，表明該制劑成功形成，同時沒有出現新的吸收峰，表明原料藥與β-環糊精包合物之間沒有形成共價鍵，而是以非共價鍵形式結合。

2.5.2 X射線衍射(XRD) 取原料藥、β-環糊精、物理混合物、β-環糊精包合物適量，在2θ0°～80°范圍內進行分析，結果見圖3。由此可知，原料藥呈晶形結構，明顯特征峰出現在9.58°處；β-環糊精也呈晶形結構，明顯特征峰出現在13.26°處；物理混合物存在人參皂苷Re衍射峰、β-環糊精無定形結構，其圖譜是由每個單一組分的光譜疊加組成，表明沒有新結構形成；β-環糊精包合物峰型和強度與上述樣品明顯不同，呈光暈狀的無定形狀態，9.58°、13.26°處特征峰消失，原料藥、β-環糊精的衍射峰晶形在包合前后發生顯著變化，表明兩者成功形成包合物。

2.5.3 差示掃描量熱(DSC) 在DSC分析測定曲線中，當客體分子全部或部分包含在CD腔或晶格中時，其自身特征可能不同于自然結構，一般來說其融化、沸騰或升華點可轉移到1個不同的溫度或消失[18]。取原料藥、β-環糊精、物理混合物、β-環糊精包合物適量，以氧化鋁作為參考材料，在N2保護下以10 ℃/min掃描速率程序升溫(20～300 ℃)，結果見圖4。由此可知，原料藥在95.8、112.8 ℃處分別有1個吸熱峰；β-環糊精在93.0 ℃處有1個寬的吸熱峰，可能是由于其所含水的釋放所致；物理混合物仍存在原料藥吸熱峰；β-環糊精包合物中原料藥吸熱峰消失，在104.3 ℃處出現了1個新的吸熱峰，表明原料藥與β-環糊精成功形成包合物。

2.5.4 掃描電子顯微鏡(SEM) 取原料藥、β-環糊精、物理混合物、β-環糊精包合物適量，對其形狀和表面特征進行觀察，結果見圖5。由此可知，原料藥呈塊狀晶體；β-環糊精呈碎片狀晶體；物理混合物同時存在塊狀、碎片狀晶體；β-環糊精包合物中原料藥、β-環糊精形態消失，其物相結構明顯不同于物理混合物，表明兩者形成包合物后主客分子的原晶格排列發生變化，形成新物相。

2.6 藥動學研究

2.6.1 藥液制備 稱取200 mg原料藥，加到10 mL蒸餾水中，超聲處理后充分混勻，制成20 mg/mL混懸液；稱取500 mg β-環糊精包合物(原料藥含量為40.07%)，加到10 mL蒸餾水中，超聲處理后充分混勻，制成50 mg/mL混懸液。

2.6.2 分組、給藥與采血 12只大鼠隨機分為2組，每組6只，適應性飼養1周，給藥前禁食不禁水12 h，分別一次性灌胃給予“2.6.1”項下2種藥液，劑量均為100 mg/kg，于0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、9、10、12、24 h眼眶靜脈叢采血各約0.5 mL，置于肝素鈉抗凝處理的1.5 mL離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，分離得到上層血漿，在-80 ℃下保存。

2.6.3 HPLC-MS/MS分析條件

2.6.3.1 色譜 反相Accucore C18分析柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流動相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5.0 min，25%～30%B；5.0～8.0 min，30%～32%B；8.0～9.0 min，32%～36%B；9.0～16.0 min，36%～37%B；16.0～16.8 min，37%～48%B；16.8～17.8 min，48%～70%B；17.8～18.8 min，70%～90%B；18.8～20.8 min，90%～25%B；20.8～25 min，25%B)；體積流量0.2 mL/min；柱溫30 ℃；自動進樣器溫度4 ℃；進樣量5 μL。

2.6.3.2 質譜 電噴霧離子源(ESI)，負離子多級反應監測模式(MRM)；噴霧電壓3 kV；毛細管溫度325 ℃；霧化器溫度275 ℃；鞘氣、輔助氣壓力30、10 arb；人參皂苷Re、人參皂苷Rf均采用[M+HCOO]-離子進行多級反應監測(MRM)，前者m/z991.5～945.5，945.5～637.3，637.3～475.3；后者m/z845.48～799.31, 799.31～637.3，637.3～475.3；碰撞能量55、45 eV。

2.6.4 對照品、內標溶液制備 精密稱取人參皂苷Re對照品5.00 mg，5 mL 80%甲醇制成1 mg/mL對照品溶液；同法將人參皂苷Rf對照品制成10 ng/mL內標溶液，在4 ℃下保存。

2.6.5 血漿處理 精密移取血漿0.1 mL、內標溶液20 μL、50%甲醇80 μL，加入0.5 mL甲醇-乙腈(60∶40)混合溶液進行蛋白沉淀，渦旋振蕩3 min，12 000 r/min離心10 min，分離出上清液，40 ℃氮氣流蒸干，殘余物用0.2 mL 80%甲醇溶解，過0.22 μm有機濾膜，進行HPLC-MS/MS分析(進樣量5 μL)，內標法計算人參皂苷Re血藥濃度。

2.6.6 線性關系考察 分別將對照品、內標溶液加到空白血漿中，制備血漿對照品、內標溶液，兩者質量濃度分別為0.05～100、1 ng/mL，按“2.6.5”項下方法處理，在“2.6.3”項條件下進樣測定。以對照品、內標峰面積比值為橫坐標(X)，對照品質量濃度為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=0.233 4X+1.564 5(R2=0.993 6)，在0.05～100 ng/mL范圍內線性關系良好。同時，信噪比(S/N)≥3時檢測限為0.001 6 ng/mL，S/N≥10時定量限為0.005 3 ng/mL。

2.6.7 專屬性、基質效應考察 取空白血漿、血漿質控樣品(含0.05 ng/mL人參皂苷Re)、給藥24 h后血漿適量，按“2.6.5”項下方法處理，在“2.6.3”項條件下進樣測定，結果見圖6。由此可知，對照品、內標分離度良好，內源性血漿物質無明顯干擾。取低、中、高質量濃度(0.05、10、100 ng/mL)血漿質控樣品適量，按“2.6.5”項下方法處理，在“2.6.3”項條件下進樣測定，同法分析含內標的相同質量濃度對照品溶液和內標溶液，測得人參皂苷Re基質效應分別為103.69%、98.45%、95.07%，內標基質效應分別為95.26%、96.33%、94.81%，表明該方法具有較好的專屬性，可有效避免基質效應對測定結果的影響。

2.6.8 精密度、準確度、提取回收率、穩定性試驗 按“2.6.6”項下方法制備低、中、高質量濃度(0.05、10、100 ng/mL)對照品溶液及含1 ng/mL內標的血漿質控樣品溶液，按“2.6.5”項下方法處理，同一天內在“2.6.3”項條件下進樣測定6次，計算日內精密度；同法連續測定3 d，每天1次，計算日間精密度，測得前者RSD分別為6.72%、4.16%、8.36%，后者RSD分別為 8.03%、5.69%、9.10%，表明該方法精密度良好。準確度用相對方法回收率表示，測得日內準確度分別為104.01%、107.80%、104.32%，日間準確度分別為106.71%、105.18%、91.37%，表明該方法準確度良好。取上述質量濃度血漿質控樣品溶液各0.1 mL，按“2.6.5”項下方法處理，在“2.6.3”項條件下進樣測定，同時取0.1 mL相同來源的空白血漿，按“2.6.5”項下方法處理，加入與血漿質控樣品相同質量濃度的對照品溶液和內標溶液，在“2.6.3”項條件下進樣測定，計算提取回收率，公式為提取回收率=(C/S)×100%，其中C為血漿質控樣品溶液中人參皂苷Re峰面積，S為對照品溶液中人參皂苷Re峰面積，結果分別為91.24%、94.16%、95.18%。取上述3個質量濃度的血漿質控樣品溶液適量，分別在4 ℃下保存24 h、-20 ℃下進行3次凍融循環、-80 ℃下保存30 d，按“2.6.5”項下方法處理，在“2.6.3”項條件下進樣測定，測得人參皂苷Re峰面積RSD分別為4.65%、5.11%、8.35%，表明樣品在上述條件下均具有良好的穩定性。

2.7 結果分析 大鼠灌胃給藥后，繪制血藥濃度-時間曲線，見圖7，再采用Phoenix WinNonlin 8.1藥動軟件(美國Pharsight 公司)中的非房室模型統計矩方法計算主要藥動學參數，結果見表1。由此可知，與原料藥比較，β-環糊精包合物Cmax、AUC0～24 h、AUC0～∞升高(P<0.05)，CLt、Vdss降低(P<0.05)，T1/2、MRT延長(P<0.05)，Tmax縮短(P<0.05)，相對生物利用度為191.01%。

表1 人參皂苷Re主要藥動學參數

3 討論

本實驗將水溶性較差的人參皂苷Re與β-環糊精制成包合物，通過FT-IR、XRD、DSC表征發現，包合后該成分熱性質、晶體形貌等參數發生明顯變化，表明包合物成功形成。再建立HPLC-MS/MS法測定人參皂苷Re血藥濃度，發現包合物可增加Cmax，縮短Tmax，提高相對生物利用度，其原因可能是由于β-環糊精含有多個親水性的醇羥基，使包合物具有良好的可濕潤性，在水中的溶解度得到改善，藥物分子更易通過生物細胞膜和血腦屏障[19]；包合物體內半衰期延長，可能是由于包合作用使人參皂苷Re溶解性增加，從而加速藥物吸收，提高血藥濃度，導致機體清除時間延長。

研究表明，β-環糊精及其衍生物可耗竭細胞膜上膽固醇，改變其結構、通透性，從而抑制與口服藥物生物利用度密切相關的P-糖蛋白活性[20]，使藥物進入腸上皮細胞的機率、進入肝腸循環的藥物增加，導致MRT、T1/2延長。本實驗發現，包合物藥動學曲線消除相上有峰波動，可能是由于腸胃循環中人參皂苷Re在胃腸道不同位置吸收速率的差異所致[21]。除此之外，腸肝循環也是重要原因之一，并受某些酶的水解作用或重吸收過程中膽汁間歇性釋放的影響，導致產生2個或多個峰，并且藥物由于分布于腎臟、心臟、肝臟，其再分配效應也可能會造成多峰現象[22]，這對人參皂苷Re相關劑型的開發具有重要參考意義。