粉防己堿納米晶體的制備及質量評價

薛 飛， 程炳鐸， 劉喜綱， 常金花， 劉 沛， 薛禾菲， 王汝興

(承德醫學院中藥研究所，河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北 承德 067000)

在藥物合成或研發過程中，其本身有將近50%是水難溶性，溶解性差、生物利用度低、吸收不穩定正成為主要問題[1-2]。納米晶體由于其靶向遞送作用和低毒性，在疾病診療中發揮著重要作用[3]，并且具有納米尺寸和更好的溶解性，可改變藥物藥動學和生物分布[4-5]。

粉防己堿為異喹啉類生物堿，是傳統中藥防己的主要成分，具有抗炎、抗腫瘤、降壓等藥理作用[6-7]，目前在臨床用藥中以中藥復方制劑為主[8]，但該成分胃腸道吸收較差，導致口服生物利用度低。因此，本實驗將粉防己堿制成納米晶體，并評價其質量，以期為相關應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 恒溫水浴鍋(金壇市天竟實驗儀器廠)；GT16-3高速離心機(北京時代北利離心機有限公司)；ZEN3690激光粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；QM3SP2行星式球磨機(南京馳順科技發展有限公司)；LGJ-22D冷凍干燥機(北京四環科學儀器廠有限公司)；Nexus傅立葉紅外光譜儀(美國熱電尼高力公司)；DMax-2400 X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；EQUINOX55傅里葉變換紅外光譜儀(德國布魯克光譜儀器公司)；掃描電子顯微鏡(日本尼康儀器公司)。

1.2 試劑與藥物 粉防己堿對照品(成都普菲德生物技術有限公司，純度99.85%)；粉防己堿原料藥(西安山川生物技術有限公司)。羥丙基甲基纖維素(HPMC-E5, 北京鳳禮精求醫藥股份有限公司)；乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物(PVP-VA64, 德國BASF公司)；吐溫-80(Tween-80, 天津市光復精細化工研究所)；泊洛沙姆407(P407, 北京鳳禮精求醫藥股份有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮-K30(PVP-K30, 山東優索化工科技有限公司)；聚乙二醇-4000(PEG-4000, 北京鳳禮精求醫藥股份有限公司)；聚乙烯己內酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus, 德國BASF公司)。其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 粉防己堿含量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent ODS C18色譜柱(4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流動相乙腈-0.01 mmol/L磷酸二氫鉀(含0.1%三乙胺)(80∶20)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取粉防己堿對照品2.00 mg，置于10 mL量瓶中，少量甲醇超聲溶解后定容，得200.00 μg/mL貯備液，甲醇依次稀釋至3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL，作為對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為Y=6.879X+0.971(R2=0.999 9)，在3.13～100.00 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取1 mL納米晶體溶液至10 mL量瓶中，去離子水稀釋至刻度，即得。

2.1.4 專屬性考察 取對照品溶液、供試品溶液、空白輔料適量，甲醇稀釋，搖勻，超聲處理，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，三者之間無相互干擾，表明該方法專屬性良好。

2.1.5 精密度試驗 取4.0、50.0、80.0 μg/mL對照品溶液，同一天在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，考察日內精密度；同法連續測定3 d，每天1次，考察日間精密度，測得日內精密度RSD分別為0.29%, 0.15%、0.16%，日間精密度RSD分別為0.37%、0.48%、0.51%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 加樣回收率試驗 分別精密量取0.3、2.0、4.0 mL 200.0 μg/mL對照品溶液各3份，置于10 mL量瓶中，加入1.0 mL空白載體溶液，流動相定容，分別得到6.00、40.00、80.00 μg/mL溶液各3份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，粉防己堿平均加樣回收率分別為101.62%、100.68%、99.37%，RSD分別為0.34%、1.68%、0.98%。

2.2 納米晶體制備 采用濕法研磨法[9]。在50 mL燒杯中加入適量去離子水，加入不同種類穩定劑適量，攪拌分散至溶解，再加入不同比例原料藥，磁力攪拌至均勻分散，得粗混懸液，加到研磨罐中，與不同規格研磨珠混合后置于球磨機中，制得納米混懸液，精密吸取1 mL至西林瓶中，加入不同種類凍干保護劑適量，置于-80 ℃低溫冰箱中預凍4 h后進行冷凍干燥，即得。

2.3 制備工藝優化 采用單因素試驗。

2.3.1 穩定劑種類 按“2.2”項下方法制備納米混懸液30 mL，共8份，考察HPMC-E5、PVP-VA64、Tween-80、P407、PVP-K30、PEG-4000、Soluplus對其粒徑、PDI(將100 μL納米混懸液用去離子水稀釋400倍，采用激光粒度儀測定)的影響，結果見圖2。由此可知，穩定劑為P407時，納米混懸液粒徑最小，PDI在0.2～0.3范圍內；為Tween-80時，納米混懸液粒徑與為P407時相差不大，但PDI在0.6～0.8范圍內，表明其分布不均勻；其他穩定劑所得納米混懸液的粒徑、PDI并不能達到理想效果。最終，選擇P407作為穩定劑。

2.3.2 粉防己堿與穩定劑比例 按“2.2”項下方法制備納米混懸液，考察粉防己堿與P407比例1∶1、3∶1、7∶1、10∶1對其粒徑、PDI的影響，結果見圖3。由此可知，兩者比例為1∶1時，納米混懸液粒徑最小，PDI在0.2～0.3范圍內。最終，選擇1∶1作為粉防己堿與穩定劑比例。

2.3.3 研磨時間 按“2.2”項下方法制備納米混懸液，考察研磨時間10、40、60、80、100、120 min對其粒徑、PDI的影響，結果見圖4。由此可知，隨著研磨時間延長，納米混懸液粒徑、PDI逐漸下降，在120 min時兩者達到最小值。最終，選擇120 min作為研磨時間。

2.3.4 粉防己堿與研磨珠比例 按“2.2”項下方法制備納米混懸液，考察粉防己堿與氧化鋯珠比例1∶1、2∶3、1∶2對其粒徑、PDI的影響，結果見圖5。由此可知，兩者比例為1∶2時，納米混懸液粒徑最小，PDI最理想。最終，選擇1∶2作為粉防己堿與研磨珠比例。

2.3.5 研磨珠規格 按“2.2”項下方法制備納米混懸液，考察研磨珠規格0.2～0.3、0.4～0.8、0.8～1.0 mm對其粒徑、PDI的影響，結果見圖6。由此可知，規格為0.2～0.3 mm時，納米混懸液粒徑最小，PDI最理想。最終，選擇0.2～0.3 mm作為研磨珠規格。

2.4 凍干保護劑篩選

2.4.1 種類 按“2.3”項下優化工藝制備納米混懸液若干份，每份1 mL，分別加入葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖，用量均為2.5%，振蕩混勻，轉移到瓶中冷凍干燥，1 mL去離子水復溶，測定其粒徑、PDI，結果見圖7。由此可知，甘露醇為凍干保護劑時，納米混懸液粒徑最小，PDI最理想。最終，選擇甘露醇作為凍干保護劑。

2.4.2 用量 按“2.3”項下優化工藝制備納米混懸液，考察0、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%甘露醇對其粒徑、PDI的影響，結果見圖8。由此可知，用量為2.5%時，納米混懸液粒徑最小，PDI最理想。最終，選擇2.5%作為凍干保護劑用量。

2.5 溶出度測定 采用槳法，并設定轉速為100 r/min，每批樣品進行3次平行試驗。精密稱取原料藥14.00 mg、納米晶體100.00 mg、物理混合物(原料藥+P407+甘露醇)28.82 mg，加到900 mL 37 ℃純水(含0.2%SDS)中，于5、10、20、30、45、60 min各取樣5 mL，立即補充37 ℃純水，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算累積溶出度，繪制溶出曲線，結果見圖9。

由此可知，納米晶體溶出度從10 min開始均接近100%，即幾乎全部溶出；物理混合物累積溶出度低于納米晶體，但高于原料藥；60 min內三者累積溶出度分別為94.32%，76.21%、52.09%，表明將粉防己堿制成納米晶體后可顯著改善其溶出度。

2.6 質量評價

2.6.1 平均粒徑、Zeta電位測定 取納米晶體適量，1 mL去離子水復溶，精密量取20 μL，去離子水稀釋200倍，激光粒度儀測定平均粒徑，結果見圖10。由此可知，納米晶體粒徑為(128.22±6.25)nm，PDI為0.13±0.02，Zeta電位為(7.57±0.42)mV。

2.6.2 掃描電鏡 取原料藥、復溶后納米晶體適量，在掃描電鏡下觀察兩者形態，結果見圖11。由此可知，前者形態為塊狀，后者形態為棒狀。

2.6.3 X射線衍射

分別取空白輔料(P407、甘露醇)、原料藥、物理混合物、納米晶體約10 mg，進行X射線衍射分析，設定條件為Cu靶/石墨單色器；掃描范圍3°～40°；電流30 mA；電壓40 kV，結果見圖12。

由此可知，原料藥呈現多個尖峰，表明以晶體形式存在；空白輔料具有結晶度低于原料藥的尖峰；在物理混合物對應位置也存在與原料藥相同、強度較高的衍射峰；納米晶體中粉防己堿在11.69°、17.30°處的衍射峰消失，并且其他特征衍射峰強度有不同程度的減弱，表明有一部分轉變為無定形狀態。

3 討論

根據Ostwald Freundlich理論，小顆粒比大顆粒具有更高的飽和溶解度，由兩者之間濃度梯度導致溶解的藥物分子從小顆粒擴散后，聚集在大顆粒表面，并導致顆粒增大[10-11]，故需加入穩定劑以使藥物粒子大小盡量均一[12-13]。本實驗中穩定劑選擇P407，其粒徑、PDI均優于其他穩定劑，當粉防己堿與其比例為1∶1時，上述2種參數最理想。

介質研磨法是最常用的制備納米晶體方法，但在研磨過程中會產生磨損，從而對納米藥物形成產生一定影響[14-15]，同時若研磨時間過短，無法使藥物均勻分散，而過長又會導致納米粒子聚集，藥物穩定性降低，最終使其粒徑變大[16]。本實驗發現，延長研磨時間有利于納米晶體粒徑減小，但在100 min后變化不明顯，故確定研磨時間為120 min。

采用冷凍干燥法固化粉防己堿納米晶體時，可增加其穩定性，但在操作過程中易引起粒子聚集，故需加入適宜凍干保護劑以減少上述現象發生[17]。研究表明，小分子量糖與糖醇的相互作用或空間效應較強，其抗聚焦能力優于高分子糖[18-19]，故本實驗選擇2.5%甘露醇作為凍干保護劑。

本實驗所制備的粉防己堿納米晶體為質地疏松、色澤均勻的白色粉末，復溶后易分散，X射線衍射分析顯示，部分晶型發生變化，轉化為無定形狀態，其原因可能是采用介質研磨法制備時晶體中分子排列的緊密程度有所下降，干擾了藥物結晶狀態[20]，而峰強度降低可能是由于顆粒大小減少、結晶度改變所致[21]。另外，本實驗還發現藥物結晶度越低，溶出速率越快，具體機制有待進一步研究。