野黃芩苷聯合奧沙利鉑對結腸癌細胞的作用

楊海軍， 嚴寶飛， 張 寧， 劉美輝

(江蘇衛生健康職業學院，江蘇 南京 211800)

結腸癌是全世界范圍內第三大最常見的惡性腫瘤類型，同時被認為是最致命的癌癥之一[1-2]。近年來，隨著人們生命周期的延長，結腸癌發病率正迅速增加[3-4]。盡管在結腸癌治療方面已取得了重大進展，但患者預后仍不理想，術后并發癥及死亡率居高不下[4]。目前，結腸癌的靶向藥物治療和免疫治療取得了突破性進展，但這些療法對于患者基因屬性要求較高，且成本高昂，故化療依然是治療結腸癌的主要選擇[5-6]。奧沙利鉑為結腸癌的一線化療藥物，但長期應用其化療可造成結腸癌細胞耐藥性，進而導致治療失敗[3-4]。因此，尋找能夠改善結腸癌細胞奧沙利鉑耐藥性的藥物迫在眉睫。

黃酮類成分野黃芩苷在唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的根、莖、葉中含量較高，具有抗腫瘤、抗炎、抗血栓形成、神經保護等顯著作用[7-9]。據報道，野黃芩苷能增敏順鉑對肺癌A549/DDP耐藥細胞的增殖抑制、促凋亡和自噬作用，同時降低順鉑腎毒性[10]。但尚未有研究報道野黃芩苷是否能增敏奧沙利鉑抗結腸癌作用，故本研究以結腸癌細胞HCT116為對象，基于細胞活力、凋亡和自噬角度研究野黃芩苷聯合奧沙利鉑對HCT116細胞的作用，并初步探討這些作用的可能機制，以期為改善結腸癌細胞奧沙利鉑耐藥提供思路。

1 材料與方法

1.1 細胞系 人源結腸癌HCT116細胞，購自美國典型培養物保藏中心，使用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、飽和濕度的CO2細胞培養箱中培養。

1.2 試劑與藥物 奧沙利鉑(純度≥99%，批號0124003)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；野黃芩苷(純度≥98%，批號YHQG20210106)，購自南京秋實生物科技有限公司。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，批號V900090)、DMEM培養基(批號D6429)，購自德國默克公司；AnnexinV-FITC/PI試劑盒(批號C1062S)，購自上海碧云天生物技術有限公司；Hochest染液(33342，批號BL803A)、JC-1熒光探針試劑盒(批號BL711A)，購自合肥白鯊生物科技有限公司；聚偏氟乙烯膜(PVDF，批號LC2002)、胎牛血清(批號10099141C)、BCA蛋白定量試劑盒(批號23246)，購自美國Thermo公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，批號5174T)、一抗微管相關蛋白l輕鏈3(LC3，批號12741S)、p62(批號23214S)、B細胞淋巴瘤2相關X蛋白(Bax，批號5023T)、B細胞淋巴瘤2(Bcl-2，批號15071T)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3，批號9661T)、二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(HRP-IgG，批號32935S)，購自美國Cell Signaling Technology公司；細胞計數試劑盒8(CCK8，批號ab228554)、一抗p53(批號ab26)、細胞外調節蛋白激酶(ERK，批號ab184699)、磷酸化的細胞外調節蛋白激酶(p-ERK，批號ab201015)、蛋白激酶B(Akt，批號ab38449)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt，批號ab8805)、間質表皮轉化因子(c-Met，批號ab51067)，購自英國Abcam公司。

1.3 儀器 PLUS-E2-20TJ型純水系統，購自南京易普易達科技發展有限公司；TS100型和TS2R型顯微鏡，購自日本尼康公司；MultiskanMK3型酶標儀，購自美國Thermo公司；FACS Calibur型流式細胞儀，購自美國BD公司；MINI-4型垂直電泳儀，購自美國Bio-Rad公司。

1.4 藥物配制 精密稱取野黃芩苷和奧沙利鉑適量，分別溶于無菌DMSO中，配制成200 mmol/L野黃芩苷母液(-20 ℃條件下保存備用)和60 mmol/L奧沙利鉑母液(現配現用)，再以培養基稀釋至實驗所需濃度。

1.5 CCK8法檢測HCT116細胞活力

1.5.1 野黃芩苷對細胞活力的影響 取對數生長期HCT116細胞接種于96孔板，培養24 h，分別加入100 μL含0.1% DMSO(空白組)及40、80、120、160、200、240、280 μmol/L野黃芩苷的DMEM培養基，繼續培養24 h，每孔加入10 μL CCK8試劑，培養2 h，采用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度(A)，另設置不作任何處理的空白孔調零，計算細胞活力。

1.5.2 奧沙利鉑對細胞活力的影響 HCT116細胞按“1.5.1”項下方法處理，以100 μL含0.1% DMSO(空白組)及10、20、30、40、50、60 μmol/L奧沙利鉑的DMEM培養基培養24 h，計算細胞活力。

1.5.3 野黃芩苷聯合奧沙利鉑對細胞活力的影響 HCT116細胞按“1.5.1”項下方法處理，分為空白組、20 μmol/L奧沙利鉑組、25 μmol/L野黃芩苷組、50 μmol/L野黃芩苷組、20 μmol/L奧沙利鉑+25 μmol/L野黃芩苷組和20 μmol/L奧沙利鉑+50 μmol/L野黃芩苷組，隨后加入含對應藥物的DMEM培養基，空白組加入含0.1% DMSO的DMEM培養基，培養24 h，計算細胞活力。

1.6 Hochest染色觀察細胞凋亡情況 取對數生長期HCT116細胞接種于24孔板，培養24 h，分為空白組(含0.1% DMSO培養基)、奧沙利鉑組(20 μmol/L奧沙利鉑)、野黃芩苷組(50 μmol/L野黃芩苷)、藥物聯用組(20 μmol/L奧沙利鉑+50 μmol/L野黃芩苷)，加入相應藥物繼續培養24 h，參考文獻[11]報道進行Hochest染色，并于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率 HCT116細胞按“1.6”項下方法進行分組及給藥，參考文獻[11]報道進行Annexin V/PI雙染實驗，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位變化 HCT116細胞按“1.6”項下方法進行分組及給藥，參考文獻[12]報道進行JC-1熒光探針染色。正常細胞線粒體JC-1聚集在基質中，以發射紅色熒光的聚合物存在；凋亡細胞JC-1主要存在于胞漿中，以發射綠色熒光的單體形式存在，因此，細胞JC-1探針由紅色熒光轉為綠色熒光時，可反映線粒體膜電位的變化。

1.9 Western blot法檢測凋亡、自噬及上游相關蛋白表達 HCT116細胞按“1.6”項下方法進行分組及給藥，參考文獻[11]報道進行電泳、轉膜、封閉，一抗(ERK1/2、p-ERK1/2、p53、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Akt、p-Akt、c-Met、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，HRP標記的二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，ECL化學發光法顯影、成像，分析條帶灰度值，以GAPDH為內參計算目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 野黃芩苷、奧沙利鉑及聯合用藥對HCT116細胞活力的影響 如圖1所示，野黃芩苷、奧沙利鉑均能抑制HCT116細胞活力，干預24 h的IC50值為185.10、40.05 μmol/L，并呈現劑量依賴性，因此選擇遠低于其IC50值的25、50 μmol/L野黃芩苷和20 μmol/L奧沙利鉑進行后續實驗。如圖2所示，與空白組比較，野黃芩苷各濃度組均對HCT116細胞無抑制作用(P>0.05)，而奧沙利鉑組及野黃芩苷聯合奧沙利鉑組均能抑制HCT116細胞活力(P<0.01)；此外，野黃芩苷各濃度聯合奧沙利鉑組對HCT116細胞活力的抑制作用均強于奧沙利鉑組(P<0.05，P<0.01)，提示野黃芩苷能夠協同奧沙利鉑抑制HCT116細胞活力。

2.2 野黃芩苷聯合奧沙利鉑對HCT116細胞生長的影響 空白組呈上皮細胞樣細胞貼壁生長，狀態正常；奧沙利鉑組和野黃芩苷組出現少量凋亡細胞；藥物聯用組HCT116細胞體積縮小，與周圍細胞脫離，出現大量凋亡細胞，見圖3。結果提示，野黃芩苷能夠協同奧沙利鉑促進HCT116細胞凋亡。

2.3 Hochest染色檢測野黃芩苷聯合奧沙利鉑對HCT116細胞凋亡的影響 空白組細胞核呈現彌散均勻藍色熒光，形態正常；奧沙利鉑組和野黃芩苷組出現少量濃染致密的顆粒塊狀藍色熒光；藥物聯用組出現大量濃染致密的顆粒塊狀藍色熒光，細胞凋亡特征明顯，見圖4。結果提示，野黃芩苷可協同奧沙利鉑促進HCT116細胞凋亡。

2.4 流式細胞術檢測野黃芩苷聯合奧沙利鉑對HCT116細胞凋亡的影響 與空白組比較，各用藥組HCT116細胞凋亡率均升高(P<0.05，P<0.01)，且藥物聯用組HCT116細胞凋亡率高于奧沙利鉑組(P<0.01)，見圖5。結果提示，野黃芩苷可協同奧沙利鉑促進HCT116細胞凋亡。

2.5 野黃芩苷聯合奧沙利鉑對HCT116細胞線粒體膜電位的影響 空白組HCT116細胞JC-1染色以紅色熒光為主；奧沙利鉑組和野黃芩苷組細胞JC-1染色仍然以紅色熒光為主；藥物聯用組細胞JC-1染色由紅色熒光向綠色熒光偏移，見圖6。結果提示，野黃芩苷可協同奧沙利鉑降低HCT116細胞線粒體膜電位水平。

2.6 野黃芩苷聯合奧沙利鉑對HCT116細胞中凋亡及其上游蛋白表達的影響 與空白組比較，奧沙利鉑組cleaved caspase-3蛋白表達和ERK1/2蛋白磷酸化水平升高(P<0.05)，野黃芩苷組cleaved caspase-3蛋白表達升高(P<0.01)，藥物聯用組Bax/Bcl-2蛋白表達比值、cleaved caspase-3和p53蛋白表達及ERK1/2蛋白磷酸化水平均升高(P<0.01)；與奧沙利鉑組比較，藥物聯用組Bax/Bcl-2蛋白表達比值、cleaved caspase-3和p53蛋白表達及ERK1/2蛋白磷酸化水平均升高(P<0.01)，見圖7。結果提示，野黃芩苷可協同奧沙利鉑發揮促凋亡作用，其機制可能與激活ERK/p53信號通路有關。

2.7 野黃芩苷聯合奧沙利鉑對HCT116細胞中自噬及其上游蛋白表達的影響 與空白組比較，奧沙利鉑組p62蛋白表達降低(P<0.01)，野黃芩苷組p62蛋白表達降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比值升高(P<0.01)，藥物聯用組p62、c-Met蛋白表達和Akt蛋白磷酸化水平均降低(P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比值升高(P<0.01)；與奧沙利鉑組比較，藥物聯用組p62、c-Met蛋白表達及Akt蛋白磷酸化水平均降低(P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比值升高(P<0.01)，見圖8。結果提示，野黃芩苷可協同奧沙利鉑發揮促自噬作用，其機制可能與抑制c-Met/Akt信號通路有關。

3 討論

細胞凋亡是細胞的程序性死亡形式，可有序、有效去除受損細胞。凋亡細胞死亡機制的失調是腫瘤發生和進展的標志，亦是腫瘤產生耐藥性的重要原因[13-14]。線粒體途徑是凋亡發生的主要途徑之一，受到Bcl-2家族調節。Bcl-2家族成員之間的平衡及相互作用是確定細胞是否存活或凋亡的關鍵。正常細胞的促凋亡蛋白Bax主要存在于胞質中，而抗凋亡蛋白Bcl-2存在于線粒體膜上[15]。當線粒體凋亡啟動，Bax易位至線粒體中，增加線粒體膜通透性并激活caspase-3，啟動caspase級聯反應，使凋亡進入不可逆階段[16-17]。Bcl-2能夠拮抗Bax的線粒體膜孔形成活性，故Bax/Bcl-2是線粒體凋亡啟動的標志[13]。本研究發現，與單獨使用奧沙利鉑比較，野黃芩苷聯合奧沙利鉑能夠上調HCT116細胞Bax/Bcl-2蛋白表達比值及cleaved caspase-3蛋白表達，表明野黃芩苷能夠協同奧沙利鉑發揮促凋亡作用。蛋白激酶ERK包括ERK1/2，磷酸化的ERK1/2由胞質轉移至胞核內，進而活化多種轉錄因子。ERK在多種腫瘤中高度激活，驅動生長，抑制凋亡[18-19]。同時，ERK可以被抗腫瘤藥物激活，從而觸發其下游p53等腫瘤抑制蛋白，誘導腫瘤細胞發生p53依賴的細胞凋亡[20-21]。本研究發現，與單獨使用奧沙利鉑比較，野黃芩苷聯合奧沙利鉑能夠上調HCT116細胞ERK1/2蛋白磷酸化水平及p53蛋白表達，表明野黃芩苷聯合奧沙利鉑協同促凋亡機制可能與激活ERK/p53信號通路有關。

LC3是自噬發生的標志之一。自噬形成時，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)轉變為膜型LC3(即LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與自噬水平呈正相關[22-23]。p62被證實為自噬清除的標志，可在自噬過程中被降解[24]。本研究發現，與單獨使用奧沙利鉑比較，野黃芩苷聯合奧沙利鉑能夠提升HCT116細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比值，抑制p62蛋白表達，表明野黃芩苷可協同奧沙利鉑發揮促自噬作用。c-Met為受體酪氨酸激酶家族成員，在結腸癌中可被激活，與腫瘤的發生、發展和治療耐藥性聯系緊密[25]。據報道，c-Met的低表達可誘導肺胰腺癌等腫瘤細胞發生自噬，在調節細胞自噬中發揮重要作用[26-27]。c-Met下游重要途徑磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在各種癌癥的自噬中也可發揮調控作用，如抑制其表達可激活前列腺癌細胞自噬[28]，Akt抑制劑MK-2206可誘導耐藥肺癌細胞A549/DDP發生自噬[29]。本研究發現，與單獨使用奧沙利鉑比較，野黃芩苷聯合奧沙利鉑能夠下調HCT116細胞c-Met蛋白表達和Akt蛋白磷酸化水平，表明野黃芩苷聯合奧沙利鉑促進自噬可能與抑制c-Met/Akt信號通路有關。

綜上所述，野黃芩苷能夠協同奧沙利鉑發揮抑制HCT116細胞活力，并誘導凋亡和自噬，其潛在機制可能與激活ERK/p53和抑制c-Met/Akt信號通路有關。課題組后期將圍繞結腸癌細胞、結腸癌耐藥細胞設計驗證實驗，以期深入揭示野黃芩苷和奧沙利鉑協同作用機制。