磷霉素細菌耐藥機制研究進展

李泰階，蔣誠傳，林青

(廣西醫科大學附屬武鳴醫院醫學檢驗科，南寧 530199)

磷霉素是一種由鏈霉菌屬合成的天然抗生素，具有特殊的化學結構，化學名為(1R，2S)-1，2-環氧順丙烯磷酸。磷霉素口服30%～40%可由胃腸道吸收，且不受食物的影響，2～4 h血藥濃度達到峰值。其不與血漿蛋白進行結合，半衰期為1.5～2.0 h。磷霉素進入人體后組織分布廣，以腎組織中濃度最高，其次為心、肺、肝等器官組織。磷霉素對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有較好的抗菌活性。近年來，磷霉素因其特殊的殺菌機制和理化性質、無交叉耐藥、抗菌活性強、組織分布廣泛、聯合用藥時呈現協同殺菌作用等優點，重新進入臨床并在治療多重耐藥菌引起的感染中發揮重要作用[1]。隨著磷霉素耐藥性的增加，分析并研究磷霉素的耐藥機制，減緩耐藥性產生，延長其臨床使用壽命具有重要意義[2]?，F對磷霉素細菌耐藥機制進行闡述，以為磷霉素臨床合理使用、減緩其耐藥性的產生和傳播及開發新型抗菌藥物提供新思路。

1 磷霉素的發現與分子結構

磷霉素是一種廣譜抗菌藥物，于1969年由西班牙CEP公司和美國MERCK公司在鏈霉菌發酵液中首次發現[3]。磷霉素是一種天然抗生素，雖然部分菌種可產生磷霉素，但其產量普遍偏低。2006年，美國伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校的一個科研團隊通過分子克隆技術成功獲得磷霉素生物合成基因工程菌株，至此磷霉素的產量得到大幅提升[4]。磷霉素是一種磷酸衍生物，分子量極低，幾乎不與蛋白質結合。磷霉素是一種獨特的抗菌藥物，其化學結構與現有的抗生素差別較大。磷霉素的分子結構在不同藥物劑型也存在一定差異。其有兩種口服劑型：磷霉素鈣(C3H5CaO4P)和磷霉素氨丁三醇(C3H7O4P·C4H11NO3)；一種靜脈注射劑型：磷霉素二鈉(C3H5Na2O4P)[5]。

2 磷霉素的抗菌機制與抗菌活性

磷霉素對細菌的抗菌活性主要通過抑制細菌細胞壁合成中的第一步酶催化反應，干擾肽聚糖前體二磷酸尿苷-N-乙酰胞壁酸的形成。MurA(UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase)通過催化磷酸烯醇式丙酮酸轉移到二磷酸尿苷-N-乙酰葡糖胺的3′-OH端而參與肽聚糖生物合成，這是合成肽聚糖的第一個重要步驟。磷霉素是磷酸烯醇式丙酮酸的類似物，因此能代替磷酸烯醇式丙酮酸與MurA活性中心半胱氨酸的巰基進行不可逆的共價結合，使MurA失活；進而抑制二磷酸尿苷-N-乙酰氨基葡萄糖-烯丙基丙酮酸的生物合成，使細菌細胞壁的合成停滯，從而發揮殺菌作用[6]。在鳥嘌呤和胞嘧啶百分比含量較低的革蘭陽性菌中存在兩種“murA”基因(murA和murZ)，其基因產物在結構上非常相似。在肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌中，兩個基因表達產物均能維持肽聚糖的合成，MurA和MurZ兩種同工酶對磷霉素均很敏感[7]。

磷霉素主要在細菌的生長階段發揮作用。細菌需要N-乙酰胞壁酸合成肽聚糖，而磷霉素可干擾肽聚糖的合成，因此磷霉素對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌具有廣泛的活性。但少數細菌，如頭狀葡萄球菌、腐生葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、結核分枝桿菌和沙眼衣原體等對磷霉素天然耐藥。因磷霉素獨特的殺菌機制、較好的抗菌活性，不易與其他抗菌藥物產生交叉耐藥性，其已廣泛應用于多重耐藥菌感染的治療，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌、耐青霉素肺炎鏈球菌、產超廣譜β-內酰胺酶腸桿菌科細菌、產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌和耐碳青霉烯銅綠假單胞菌等[8]。

3 磷霉素的耐藥機制

隨著磷霉素在臨床的廣泛使用，細菌對其耐藥率逐漸顯現。細菌對磷霉素的耐藥機制主要包括五大類：①磷霉素靶酶MurA的突變及過表達；②磷霉素攝取減少；③磷霉素修飾酶表達；④磷霉素外排泵機制；⑤磷霉素異質性耐藥。

3.1磷霉素靶酶MurA突變及過表達 磷霉素靶酶MurA活性位點特別是磷霉素結合位點的突變，包括周邊氨基酸替換，均可導致MurA對磷霉素的結合減少，使細菌對磷霉素出現耐藥。MurA氨基酸序列第115位半胱氨酸的巰基與磷霉素發生不可逆的共價結合后，MurA失活。當MurA氨基酸序列第115位半胱氨酸突變成天冬氨酸后，MurA失去與磷霉素結合能力；磷霉素不能阻斷細菌壁的合成，導致細菌對磷霉素耐藥[9]。MurA氨基酸序列中其他位置發生突變也可導致其與磷霉素無法結合。研究發現，MurA的第369位(Asp369→Asn369)和370位(Leu370→Ile370)氨基酸發生突變，可導致細菌對磷霉素耐藥[10]。此外，MurA過表達也可導細菌對磷霉素耐藥。當誘導MurA過表達后，大腸埃希菌對磷霉素表現出耐藥[11]。murA轉錄增強可導致產志賀毒素大腸埃希菌對磷霉素耐藥[12]。對磷霉素耐藥的腸球菌的研究顯示，部分菌株MurA的氨基酸序列發生多個氨基酸替換；部分腸球菌攜帶fosB；部分腸球菌高水平表達fosX[13]。

3.2磷霉素攝取減少 磷霉素需要借助轉運攝取系統將其轉運至細胞內才能發揮抗菌活性。當轉運攝取系統編碼基因發生堿基缺失或突變導致轉運蛋白功能缺失時，細菌無法將磷霉素運輸至細胞內而導致耐藥。細菌對磷霉素轉運主要依賴葡萄糖-6-磷酸轉運系統(glucose-6-phosphate transporter，UhpT)和甘油-3-磷酸轉運系統(glycerol-3-phosphate transporter，GlpT)。其中，GlpT屬于MFS(major facilitator superfamily)超家族外排轉運蛋白；有12個跨膜α-螺旋結構的內膜蛋白，主要轉運營養成分和各種離子[14]。uhpT表達需要外源性6-磷酸葡萄糖的誘導，而glpT可在不依賴6-磷酸葡萄糖的條件下在細菌體內持續表達。UhpT和GlpT的編碼基因均由染色體編碼；染色體編碼基因及其調控基因發生突變均可導致磷霉素轉運攝取減少，最終導致細菌對磷霉素耐藥[15]。Takahata等[10]對臨床分離的磷霉素耐藥大腸埃希菌murA、uhpT、glpT進行了序列分析，發現大腸埃希菌GlpT氨基酸序列發生替換，并與甘油-3-磷酸及磷霉素的攝取減少密切相關；glpT的C端發生基因片段的插入或丟失，導致細菌對磷霉素耐藥；部分大腸埃希菌uhpT出現丟失。Nilsson等[16]在研究大腸埃希菌對磷霉素的耐藥機制時發現，uhpT和glpT均出現基因突變、重復序列、插入序列；同時他們還發現，uhpT和glpT在體內和體外的突變率存在顯著差異。

UhpT或GlpT的調控基因包括uhpA、cyaA和ptsI，其編碼的調控蛋白分別為UhpA、CyaA和PtsI。UhpA促進UhpT的表達；uhpA編碼uhpT啟動子轉錄激活所需的反應調節蛋白，當uhpA發生堿基缺失或突變時可抑制uhpT的表達[17]。glpT的表達受環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)-受體蛋白復合物的調控。當cAMP-受體蛋白復合物結合到glpT的特異性啟動子位點后促進其表達；當細胞內cAMP表達下降可導致glpT表達下調[18]。PtsI和CyaA參與細菌體內cAMP的合成。ptsI和cyaA的突變導致細胞內cAMP水平降低，下調GlpT和UhpT轉運蛋白的表達，從而減少細菌對磷霉素的攝取，使細菌對磷霉素耐藥[19-20]。

3.3磷霉素修飾酶表達 多種修飾酶可通過共價修飾裂解磷霉素的環氧化物部分的碳氧鍵使其失活。目前已發現的修飾酶可分為金屬酶(包括FosA、FosB、FosC和FosX等)和激酶(包括FomA和FomB)。其中，金屬酶通過添加各種底物打開環氧化物環使磷霉素失活[21]。激酶主要通過磷酸化使磷霉素失活。

FosA是一種谷胱甘肽-S-轉移酶，以Mn2+和K+作為輔因子，其通過催化谷胱甘肽添加到磷霉素的C1位置，破壞環氧化物環[22]。fosA最早被發現存在于黏質沙雷菌的質粒TN2921轉座子上。fosA主要存在于腸桿菌科、假單胞菌屬和不動桿菌屬中[23]。而其他質粒攜帶的谷胱甘肽轉移酶基因，如fosA2、fosA3、fosA5和fosA6也相繼被發現[10，24]。FosA2與FosA在氨基酸序列上具有95%的同源性[25]。fosA5編碼含139個氨基酸的蛋白質酶；FosA5在氨基酸序列上與FosA、FosA2、FosA3和FosA4有69%～80%的同源性[26]。fosA常與其他耐藥基因共存于同一質粒，如gyrA、parC、parE、CTX-M、floR、dfrA7、sul1、sul2、aadA5、aphA6、mphA、KPC、NDM；導致細菌對磷霉素、氨基糖苷類、喹諾酮類、β-內酰胺類、大環內酯類、磺胺類等抗菌藥物產生共同耐藥[27]。

目前，我國大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對磷霉素的耐藥機制主要由fosA3介導[28]。有文獻報道，7.8%的大腸埃希菌對磷霉素不敏感，其中80%的菌株攜帶fosA3；42%菌株攜帶的fosA3可通過質粒轉移[29]。另一項研究顯示，在產KPC酶肺炎克雷伯菌中，60.8%的菌株對磷霉素耐藥；在優勢克隆菌株中，fosA3和blaKPC-2位于同一個質粒上[30]。在日本分離的一株大腸埃希菌，fosA3與CTX-M位于同一質粒上[31]。

FosB是一種Mg2+依賴的L-半胱氨酸巰基轉移酶，其氨基酸序列與FosA有48%的同源性[32]。FosB主要由革蘭陽性細菌產生，包括枯草芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌等[33]。這些細菌不產生谷胱甘肽，但使用桿菌硫醇作為供體。金黃色葡萄球菌的fosB由染色體編碼，其與磷霉素的活性相關。金黃色葡萄球菌因fosB或桿菌硫醇合成機制的缺失大大增加了其對磷霉素的敏感性[34]。

FosC最早分離自產磷霉素的丁香假單胞菌PB-5123菌株中[35]。該蛋白酶由182個氨基酸殘基構成，分子量為19 000。FosC使用ATP作為底物向磷霉素添加磷酸基團使磷霉素失去活性；該反應可以被堿性磷酸酶逆轉。Wachino等[36]在研究CTX-M型大腸埃希菌對磷霉素耐藥性時首次發現FosC2。FosC2是FosC亞型，由132個氨基酸組成，其氨基酸序列與木糖氧化無色桿菌中分離的FosC具有72%的同源性[36]。FosC2可通過發揮谷胱甘肽-S-轉移酶活性使磷霉素失活。

FosX是一種水解酶，與FosA和FosB具有30%～35%的序列同源性[37]；但它是一種依賴于Mn2+的環氧化物水解酶，以水為底物，通過在磷霉素C1位置添加羥基并打開其環氧化物環使磷霉素失活。FosX 酶存在于單核細胞增生李斯特菌、肉毒梭菌和布魯菌中[38]。

FomA和FomB是分離自產磷霉素細菌(如威德摩爾鏈霉菌和弗雷德氏鏈霉菌)的一種激酶；并被證實通過磷酸化使磷霉素失活，阻止磷霉素的殺菌活性[39]。其中，FomA催化磷霉素磷酸基團磷酸化為磷霉素單磷酸；FomB將磷霉素單磷酸轉化為磷霉素二磷酸。上述兩個化學反應均由ATP和Mg2+催化[40]。

3.4磷霉素外排泵機制 目前，關于外排泵機制導致磷霉素耐藥的研究較少，僅見Tet38外排泵。Tet38外排泵是金黃色葡萄球菌染色體編碼的MFS超家族外排轉運蛋白，具有14個跨膜α-螺旋結構域，其底物包括多種化合物[41]。體外實驗證實，質粒過表達tet38和glpT突變體的金黃色葡萄球菌對磷霉素最低抑菌濃度增加，同時細菌體內磷霉素含量降低，并受甘油-3-磷酸影響。當Tet38外排泵發生基因突變可導致細菌對磷霉素最低抑菌濃度降低，菌體內磷霉素濃度升高，說明Tet38是磷霉素的外排轉運蛋白[42]。Xu等[43]通過分子生物學技術對磷霉素耐藥的金黃色葡萄球菌進行研究發現，隨著磷霉素濃度的增加，耐藥菌tet38表達量增加。

3.5磷霉素異質性耐藥 細菌異質性耐藥是指分離菌株中含有細胞亞群，與主要群體相比，這些細菌亞群對抗生素的敏感性顯著降低[44]。目前，磷霉素的異質性耐藥研究主要集中于肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌。體外實驗證實，肺炎鏈球菌對磷霉素可產生異質性耐藥且同時表達MurA；當敲除murA后，耐藥菌株的異質性耐藥現象消失[45]。與非異質性耐藥菌株的不同，異質性耐藥菌株MurA(Ala364→Thr364)中的單個氨基酸發生突變；當將突變murA導入無異質性耐藥菌株后，其異質性耐藥現象并未出現，推測異質性耐藥的原因是由多種機制共同導致。一項針對銅綠假單胞菌的研究，通過菌群譜分析法實驗證實所有測試的銅綠假單胞菌中均存在異質性耐藥；時間殺菌實驗顯示，采用不同濃度的磷霉素處理后均可導致對磷霉素敏感的菌株完全被磷霉素耐藥菌株所取代[46]。

4 小 結

細菌對磷霉素的耐藥可以通過MurA的突變及過表達、磷霉素攝取減少、修飾酶表達、外排泵機制和異質性耐藥等機制單獨或聯合發揮作用。重新回歸臨床的磷霉素，不僅具有廣譜抗菌效果，同時具有良好的藥動學特點，對多重耐藥菌株仍具有較高的敏感性。當前，全球面臨多重耐藥菌抗感染與治療的重大挑戰，因此如何能夠減緩部分安全經濟的經典抗菌藥物(磷霉素等)耐藥性的產生和耐藥傳播的速度具有重要意義。未來，深入研究磷霉素的耐藥機制、傳播機制以及制訂合理的用藥方案將為臨床治療多重耐藥菌引起的感染提供廣闊的應用前景。