仙鶴草通過誘導腫瘤細胞凋亡和自噬抑制肝癌裸鼠移植瘤生長

姚雪瑞，黨 振，孫 雪，忽書霞

（南陽醫專第二附屬醫院藥械科，河南南陽 473000）

肝癌是嚴重的人類惡性疾病之一，被列為與腫瘤死亡相關的第二大常見原因。更為嚴重的是，肝癌的發病率和死亡率一直在上升，尤其是在東南亞國家[1]。盡管最近幾年在疾病診斷和治療方面取得了進展，但是肝癌患者的長期預后仍然很差，對于晚期肝癌患者，由于失去了通過手術切除和肝移植進行有效治療的可能性，總體5年生存率＜5%[2]。

來自植物的天然化學物質和代謝產物，由于其低毒性和潛在的生物學活性，在治療和預防癌癥方面的藥理作用日益受到關注。仙鶴草（Agrimonia Pilosa Ledeb，APL）是薔薇科植物龍芽草的干燥地上部分，臨床上常用于治療脫力勞傷、癰腫、肺癰、痔腫等?！陡鹱娣健分杏涊d：“滾咽隔之痰，平翻胃之穢”，說明仙鶴草對食道癌和胃癌的抗腫瘤活性。已有研究表明，仙鶴草抑制HepG2癌細胞增殖，促進其凋亡[3]，對H22肝癌皮下移植瘤小鼠腫瘤生長具有抑制作用[4]。本研究通過建立肝癌裸鼠移植瘤模型，探究仙鶴草對肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其機制，以期為仙鶴草的抗腫瘤作用提供更多的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

25只SPF級裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，雄性，6周齡，體重20±3g，許可證號：SCXK（京）2015-0001。飼養房保持濕度30%，氣溫20～25℃，每周更換滅菌墊料，按時添加裸鼠飼料及飲水。

1.2 實驗藥物和主要試劑

仙鶴草（豪州市澤信堂藥業有限公司）；5-氟尿嘧啶（上海源葉生物科技有限公司）；人肝癌細胞系HepG2（中國典型培養物保藏中心）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG均購自上海碧云天生物技術研究所；Ki67免疫組化試劑盒和VEGF免疫組化試劑盒均購自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3-I/LC3-II、Beclin1、p62和GAPDH單克隆抗體均購自英國Abcam公司。

1.3 仙鶴草水提物制備

取仙鶴草干燥全草50g，加水1000ml，浸泡1h后，煎煮30min，濾出水煎液。再將濾出的仙鶴草水煎液煎煮30min，重復3次。合并3次濾液加熱濃縮至250ml（每1ml水煎液約等于0.2g原藥材），冷凍保存。

1.4 動物模型建立及分組

取對數生長期HepG2細胞，用培養基重懸并調整細胞濃度為1×107/mL，75%的酒精消毒裸鼠皮膚后，于裸鼠右側腋窩處皮下注射0.2ml細胞懸液。接種后14d可見腫瘤生長，當腫瘤體積生長至80～100 mm3后，將荷瘤裸鼠隨機分成5組：對照組（Control）、仙鶴草低劑量組（APL 6g/kg）、仙鶴草中劑量組（APL 12g/kg）、仙鶴草高劑量組（APL 24g/kg）和5-氟尿嘧啶組（5-FU 20mg/kg）。仙鶴草低、中、高劑量組每日分別灌胃仙鶴草6、12、24g/kg[5]，5-FU組每日腹腔注射5-氟尿嘧啶20mg/kg[6]，Control組每日灌胃等量生理鹽水，連續30d。

1.5 腫瘤重量

30d后處死裸鼠，完整切取腫瘤組織，電子天平稱取腫瘤重量。

1.6 腫瘤體積

模型建立后，從第0d起每隔5d記錄所成瘤的長徑和短徑，體積=長徑×短徑2×1/2。在第30d記錄下移植瘤的長徑和短徑后，斷頸法處死裸鼠。

1.7 TUNEL染色

取部分腫瘤組織，制作石蠟切片，常規脫蠟至水；將切片浸入0.1M pH=6.0檸檬酸緩沖液中，于微波爐中處理5min，PBS洗2次；加TUNEL反應液濕盒中37℃暗反應1h，PBS洗3次；玻片干后加過氧化物酶（POD）至切片上，濕盒中37℃反應30min，PBS洗3次；加DAB室溫下反應10min后，復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并隨機選擇5個視野拍照，使用Image J分析。

1.8 Western blot

取各組裸鼠腫瘤組織，稱重后剪碎勻漿，加含蛋白酶抑制劑的裂解液于冰上充分裂解，并用BCA試劑盒測定蛋白質含量；提取等量蛋白質樣品，100℃變性5min。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉移至PVDF膜，5%的BSA室溫封閉2h后加入Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3-I、LC3-II、Beclin1和p62一抗，4℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG，室溫孵育1h，清洗。最后加入發光液后，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用ImageJ軟件統計灰度值計算相對表達量。

1.9 免疫組化

取各組腫瘤組織，常規石蠟包埋制成厚度約4μm的切片，按免疫組化檢測試劑盒說明書進行免疫組化染色，DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分色，光學顯微鏡觀察Ki67、VEGF在腫瘤組織中的表達情況。

1.10 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。正態分布計量資料以 表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 仙鶴草降低肝癌裸鼠移植瘤腫瘤重量和體積

檢測各組裸鼠腫瘤重量、體積結果如圖1所示，與Control組比較，APL 6g/kg組裸鼠腫瘤重量、體積顯著降低（P＜0.05），APL 12、24g/kg組和5-FU 20mg/kg組裸鼠腫瘤重量、體積顯著降低（P＜0.01）。

圖1 仙鶴草對肝癌裸鼠移植瘤腫瘤重量、體積的影響

2.2 腫瘤組織細胞凋亡

通過TUNEL染色檢測隔離裸鼠腫瘤組織凋亡結果如圖2A所示，與Control組比較，APL 6g/kg組裸鼠腫瘤組織細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），APL 12、24g/kg組和5-FU 20mg/kg組裸鼠腫瘤組織細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。

圖2 仙鶴草對肝癌裸鼠移植瘤腫瘤組織細胞凋亡的影響

2.3 Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平

通過Western blot檢測各組裸鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平結果如圖3所示，與Control組比較，APL 6g/kg組Caspase-3、Bax蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），APL 12、24g/kg組和5-FU 20mg/kg組裸鼠腫瘤組織細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.01）。

圖3 仙鶴草對肝癌裸鼠移植瘤Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平的影響

2.4 LC3-I、LC3-II、Beclin1和p62蛋白表達水平

通過Western blot檢測各組裸鼠LC3-I、LC3-II、Beclin1和p62蛋白表達水平結果如圖4所示，與Control組比較，APL 6g/kg組LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白水平顯著升高（P＜0.05），p62蛋白水平顯著降低（P＜0.05），APL 12、24g/kg組和5-FU 20mg/kg組LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白水平顯著升高（P＜0.01），p62蛋白水平顯著降低（P＜0.01）。

圖4 仙鶴草對肝癌裸鼠移植瘤LC3-I、LC3-II、Beclin1、p62蛋白表達水平的影響

2.5 Ki67、VEGF陽性細胞數

通過免疫組化檢測各組裸鼠Ki67、VEGF陽性細胞數結果如圖5所示，與Control組比較，APL 6 g/kg組Ki67、VEGF陽性細胞數顯著降低（P＜0.05），APL 12、24g/kg組和5-FU 20mg/kg組Ki67、VEGF陽性細胞數顯著降低（P＜0.01）。

圖5 仙鶴草對肝癌裸鼠移植瘤Ki67、VEGF陽性細胞數的影響

3 討論

原發性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，預后極差?；瘜W療法是晚期肝癌的主要治療方法，但是現有的化學療法存在療效差和不良反應等問題[7]。因此，探尋提高生存率的新治療方法至關重要。近年來的研究表明，仙鶴草具有確切的抗腫瘤作用[8]。張婷婷等[9]研究發現，仙鶴草水提物具有抑制HepG2細胞增殖，促進細胞凋亡的作用。本研究發現，仙鶴草能夠有效的降低肝癌裸鼠移植瘤腫瘤重量和體積，抑制裸鼠移植瘤的生長，進一步確認了仙鶴草的體內抗腫瘤作用。

細胞凋亡是腫瘤細胞應對異常和細胞損傷的重要細胞機制，在人類癌癥的發生發展中十分常見，誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療最基本的策略[10]。Caspase3屬Caspase家族中的凋亡執行因子，其凋亡級聯中過度活化能夠促進細胞凋亡，也表示凋亡進入不可逆階段[11]。Bax和Bcl-2屬于Bcl-2基因家族成員，Bax/Bcl-2比值反應了細胞的凋亡狀況[12]。本研究發現，仙鶴草具有上調肝癌裸鼠移植瘤Caspase-3、Bax蛋白表達水平，下調Bcl-2蛋白表達水平的作用。提示仙鶴草促進肝癌裸鼠移植瘤腫瘤組織細胞凋亡。

自噬是細胞一種自我降解的過程，當細胞受到外界刺激或能量缺乏時，機體通過溶酶體將細胞內多余和損傷的細胞器進行降解，進行循環利用。自噬可以在凋亡缺陷細胞中起到替代細胞死亡機制，通過這種機制，可以抑制腫瘤的發生與發展[13]。自噬蛋白LC3可分為LC3-I和LC3-II兩種，LC3-II定位在雙層膜和自噬體上，是自噬體的特異性標志分子，LC3-II/LC3-I的比值與自噬泡的數量呈正相關，其比值大小是判定自噬水平的高低的依據[14]。相關研究表明，Beclin1表達下調可降低細胞自噬能力，增加腫瘤發生的幾率[15]。當自噬受到抑制，p62上游表達增強或下游降解被阻斷導致p62大量聚集，因此p62水平可作為自噬流的檢測指標[16]。本研究發現，仙鶴草具有升高肝癌裸鼠移植瘤LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白表達水平，降低p62蛋白表達水平的作用。提示仙鶴草促進肝癌裸鼠移植瘤腫瘤組織細胞自噬。

VEGF在多種惡性腫瘤的病理組織中表達，其陽性表達率的升高往往表明惡性腫瘤細胞的血管生成增強，細胞轉移的風險增加[17,18]。Ki67的高表達與肝腫瘤的惡性程度和復發率呈正相關。本研究發現，仙鶴草具有降低肝癌裸鼠移植瘤Ki67、VEGF陽性細胞數的效果，表明仙鶴草抑制了肝癌裸鼠移植瘤腫瘤細胞的增殖，通過抗腫瘤血管生成對肝癌裸鼠起到治療作用。

綜上所述，本研究表明了仙鶴草可抑制肝癌裸鼠移植瘤模型腫瘤的生長，其作用機制可能通過促進腫瘤細胞凋亡或自噬實現。