過表達環狀RNA-103809調節乳腺癌細胞氧化應激和免疫

劉阿敏，趙文斌，陳保平

（1.商丘市第五人民醫院中醫外科，河南商丘 476000；2.鄭州市中心醫院）

乳腺癌是最為常見的女性惡性腫瘤，其發病率高居女性惡性腫瘤的第1位，死亡率占第2位，嚴重危害女性身心健康[1]。盡管乳腺癌的早期診斷及治療已取得一定進展，但患者整體預后仍不理想，仍需要探究更為有效的生物靶標。環狀RNA（circular RNA，circRNAs）是生物體內穩定存在的一類環狀非編碼RNA，具有重要的基因調控功能[2]。越來越多的研究數據表明，circRNAs參與人類多種腫瘤的發生發展過程[3,4]。最新研究顯示，circRNA-103809（circ103809）可通過調節微小RNA-532-3p的表達，抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移[5]。但國內關于circ103809與乳腺癌的報道較少，且circ103809對乳腺癌是否還具有其他的調控途徑尚不清楚。本研究以乳腺癌細胞MCF-7為研究對象，構建circ103809過表達細胞系，觀察過表達circ103809對MCF-7細胞的調節作用，并初步分析其作用機制，旨在為乳腺癌尋找新型腫瘤生物標志物和治療靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

乳腺癌細胞MCF-7（美國ATCC細胞庫），胎牛血清、DMEN培養基（美國Gibco），pcDNA空質粒、circRNA-103809過表達質粒由廣州吉賽生物科技股份有限公司提供，Trizol試劑（美國Invitrogen），反轉錄試劑盒（美國Promega），生化試劑盒、酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所），JC-1染色工作液、ECL發光試劑（上海碧云天生物有限公司），蛋白一抗（美國Abcam）。

1.2 細胞培養與轉染

經含有10%胎牛血清的DMEM培養基懸浮培養MCF-7細胞，置于37℃、5%CO2環境下培養，待細胞融合至80%時，添加胰蛋白酶液進行消化，取對數生長期細胞隨機分為空白對照（Control）組、陰性對照（Vector）組和circ103809組，Vector組和circ103809組分別轉染pcDNA空質粒、circRNA-103809過表達質粒，24h后收獲細胞。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測

用Trizol試劑裂解細胞提取總RNA，參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，再進行qRT-PCR擴增，以GADPH為內參，計算circ103809、白細胞介素（IL-6、IL-10）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表達。反應條件為：95℃預變性3min，95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環。

1.4 克隆形成實驗檢測細胞生長

取各組細胞調整濃度接種至12孔板，細胞數為100/孔，培養14d，每3d更換一次培養基，培養終止時吸棄培養基，固定于4%多聚甲醛中，加入適量結晶紫染色，光鏡下計數并拍照，以細胞數≥50個為集落形成標準，計算細胞集落形成率（細胞集落數/初始接種細胞數×100%）。

1.5 氧化應激標記物的檢測

收集各組細胞充分裂解后，8000r/min離心10min，取上清液，參照生化試劑盒說明書操作，檢測細胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde diethyl acetal，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量。

1.6 流式細胞術檢測線粒體膜電位

收集各組細胞，添加1ml JC-1染色工作液混勻，37℃下孵育20min，再用JC-1緩沖液洗滌細胞，以完全培養基重懸細胞，上流式細胞儀檢測，其中JC-1單體檢測為綠色熒光（線粒體膜電位低），JC-1復合物為紅色熒光（線粒體膜電位高）。

1.7 蛋白印跡（Western blot）法檢測細胞中相關蛋白的表達

用RIPA裂解液提取細胞中總蛋白，以50μg左右蛋白上樣，經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白，再冰浴下電轉至PVDF膜上，置于5%脫脂奶粉中封閉2h，然后4℃下孵育一抗（稀釋比為1:1000）過夜，37℃下孵育二抗（1:8000）1h，最后經ECL試劑進行化學發光顯示蛋白條帶，應用Image J軟件進行分析條帶灰度值。

1.8 ELISA檢測細胞炎癥因子的含量

收集各組細胞充分裂解后，8000r/min離心10min，取上清液，參照ELISA試劑盒說明書操作，檢測細胞中IL-6、IL-10和iNOS的含量。

1.9 免疫熒光檢測細胞中p65的表達

相應處理后取出細胞爬片，置于4%多聚甲醛中固定15min，通透處理后置于山羊血清中封閉30min，再加入兔抗人p65抗體（稀釋比為1:100），4℃下孵育過夜，次日加入FITC標記的山羊抗兔熒光二抗（稀釋比為1:100），37℃下孵育1h，DAPI工作液染色10min，熒光顯微鏡下觀察并計數細胞總數和p65入核的細胞數，計算p65入核陽性率。

1.10 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件分析處理數據，以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞中circ103809的表達

與Control組比較，circ103809組中circ103809的相對表達量明顯升高（P＜0.05），而Vector組的circ103809表達無明顯變化（P＞0.05），如圖1。

圖1 細胞中circ103809的表達與Control組比較，aP＜0.05

2.2 過表達circ103809對細胞增殖的影響

與Control組比較，circ103809組細胞集落形成率、Ki67、PCNA蛋白相對表達量明顯降低，p21蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），但Vector組上述指標無明顯變化（P＞0.05），如圖2。

圖2 過表達circ103809對細胞增殖的影響

2.3 過表達circ103809對細胞氧化應激水平的影響

與Control組比較，circ103809組細胞中SOD含量明顯降低，GSH和MDA含量明顯升高（P＜0.05），但Vector組上述指標無明顯變化（P＞0.05），如圖3。

圖3 過表達circ103809對細胞氧化應激水平的影響

2.4 過表達circ103809對細胞線粒體損傷的影響

與Control組比較，circ103809組細胞中綠色熒光信號增強，Bax/Bcl-2水平明顯升高，c-Myc蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05），但Vector組上述指標無明顯變化（P＞0.05），如圖4。

圖4 過表達circ103809對細胞線粒體損傷的影響

2.5 過表達circ103809對細胞炎癥因子和p65水平的影響

與Control組比較，circ103809組細胞中IL-6、iNOS表達和p65入核陽性率明顯降低，IL-10表達明顯升高（P＜0.05），但Vector組上述指標無明顯變化（P＞0.05），如圖5。

圖5 過表達circ103809對細胞炎癥因子和p65水平的影響

3 討論

隨著高通量測序技術和生物信息學分析的飛速發展，學者們發現哺乳動物中存在大量的circRNA。 circRNA由于其特殊的環狀結構，在哺乳動物細胞中具有高度的穩定性和保守性，可介導多種途徑參與機體生物學進展，如調控親本基因、充當蛋白質復合物的支架、作為微小RNA（miRNAs）分子的海綿等[6,7]。人源circ103809位于染色體5p13.3上，長度為693個核苷酸，在不同的惡性腫瘤中發揮不同的生物學作用。Liu等[8]研究發現，circ103809可螯合miR-4302上調癌基因MYC表達，從而促進肺癌的發生發展。而Li等[9]研究指出，circ103809可作為miR-620的海綿，抑制肝癌細胞的增殖和侵襲。本研究通過脂質體轉染技術構建過表達circ103809的MCF-7細胞株，經克隆形成實驗表明，過表達circ103809可明顯抑制細胞增殖。Ki67、PCNA均屬于細胞核增殖抗原，與DNA的合成密切相關，常用來評價細胞增殖活性，而p21則是一種細胞周期抑制蛋白，可使細胞周期停止在G1期，并具有廣泛的激酶抑制活性[10,11]。Western Blot檢測結果顯示，相較于對照組，circ103809組細胞中Ki67、PCNA表達下調，p21表達上調，提示過表達circ103809可能通過調控上述細胞周期蛋白表達，進而抑制乳腺癌細胞的增殖。

當機體氧化與抗氧化平衡被打破時，可能導致引物DNA、蛋白質、線粒體細胞器等氧化損傷[12]。SOD是機內主要的抗氧化酶，GSH則是過氧化物分解酶，這兩種酶類在機體抗氧化防御系統中有重要作用[13]。MDA作為脂質過氧化物的產物之一，可反映細胞內脂質過氧化反應水平[14]。本研究中，過表達circ103809后，細胞中SOD、GSH水平降低，MDA水平升高。線粒體損傷主要包括線粒體結構受損、功能紊亂及通透性增加，一般受損的線粒體可通過自噬維持腫瘤細胞的穩定，但過多的受損線粒體無法及時清除時，將介導Bax/Bcl-2通道極化形成孔道，釋放大量毒性物質進入細胞質，最終導致細胞死亡[15]。本研究通過JC-1探針檢測circ103809對線粒體膜電位的影響，結果顯示，與對照組比較，circ103809組細胞JC-1聚合物在線粒體上聚集明顯減少，Bax/Bcl-2水平升高，原癌基因c-Myc表達降低，表明過表達circ103809可能通過提升細胞內氧化應激水平，誘導線粒體損傷，進而抑制MCF-7細胞。

除了腫瘤細胞侵襲與遷移外，炎癥反應也是乳腺癌惡化的重要因素。大量研究證實，慢性炎癥與乳腺癌細胞特性的維持密切相關[16,17]。p65是炎癥反應中的關鍵轉錄因子，當外界因素刺激致使p65發生核易位后，可調控一系列與炎癥反應有關基因的表達，產生大量的炎性細胞因子，其中IL-6為強效的促炎因子，IL-10為抗炎因子[18]。同時p65的活化還可激活iNOS等相關酶類，進一步放大級聯式炎癥反應，激活炎癥介質趨化及相關炎癥細胞[19]。本研究結果顯示，上調MCF-7細胞中circ103809水平后，IL-6、iNOS表達和p65入核陽性率明顯降低，IL-10表達明顯升高，提示過表達circ103809可能通過減輕細胞中炎癥反應水平，從而對乳腺癌細胞起抑制作用。

綜上所述，過表達circ103809可抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖，可能與促進氧化應激水平、減輕炎癥反應有關，但其具體的分子作用機制還有待進一步研究。