長鏈非編碼RNA NRSN2-AS1通過miR-129-5p/Wnt5a軸靶向調控Wnt/β-catenin信號通路對食管鱗狀細胞癌發生、發展的影響

徐同欣，顏朝陽，路軍濤，李曉旭，董稚明，郭 煒

食管癌是全球病死率較高的惡性腫瘤，根據病理類型可分為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma， ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma， EAC)[1]。ESCC是我國食管癌的主要類型，約占食管癌的90%以上[2]。雖然ESCC的多學科治療取得了一定進展，但與其他惡性腫瘤相比，ESCC患者的預后仍較差，5年總生存率不足30%[3-5]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度介于200～100 000 nt的無編碼能力RNA。研究表明，lncRNA在ESCC等多種腫瘤發生、發展中起重要作用[6-8]。lncRNA NRSN2-AS1最早在卵巢癌中發現，可通過競爭性結合微小RNA(microRNA， miRNA)促進卵巢癌的進展，但其在ESCC中的作用和機制尚未完全闡明[9]。本文通過檢測NRSN2-AS1在ESCC組織及細胞中的表達，探討NRSN2-AS1過表達對Eca109細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，旨在為ESCC的靶向治療提供潛的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012年1月～2015年12月我院存檔的96例ESCC手術切除標本，其中男性患者55例，女性患者41例?；颊咝g前均未接受任何放、化療，每例患者組織標本包括ESCC組織和癌旁正常組織(距原發灶邊緣3～5 cm)。組織標本均經兩位病理醫師證實。本實驗經我院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞及主要試劑人類ESCC細胞系Eca109、TE1、TE13和KYSE150，由我院腫瘤研究所病理研究室保留并傳代。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；胎牛血清的RPMI 1640培養液購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000購自美國Thermo公司；反轉錄試劑盒、MTS試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自美國Promega公司；SYBR PCR Master Mix試劑，購自北京索萊寶公司；Transwell小室購自美國Corning公司；TOP-FLASH和FOP-FLASH質粒購自美國Millipore Corporation公司。本實驗引物、NRSN2-AS1過表達質粒和miR-129-5p mimic，均購自于上海生工公司。

1.3 細胞培養及轉染細胞系Eca109、TE1、TE13和KYSE150，均常規培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，細胞培養條件為恒溫37 ℃，CO2體積濃度為5%。將狀態良好且處于對數生長期的Eca109細胞接種于6孔板中繼續培養，當細胞生長融合70%～80%時可進行轉染。參照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書，分別或同時轉染陰性對照(pcDNA3.1-negative control，pcDNA3.1-NC)、pcDNA3.1-NRSN2-AS1或陰性對照(miR-NC)、miR-129-5p mimic。

1.4 qRT-PCR法使用TRIzol試劑提取組織或細胞總RNA，RNA提取后使用酶標儀檢測RNA樣品260/280 nm吸光度值，其數值位于1.8～2.0的樣品為合格。RNA完整性的檢測通過RNA瓊脂糖電泳進行測定，電泳結果：28、18、5 S，且28 S條帶亮度約為18 S條帶2倍則認定提取的RNA樣品合格。參照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，用于檢測NRSN2-AS1、miR-129-5p及Wnt5a mRNA的表達，以GAPDH作為內參照。qRT-PCR運行參數：95 ℃ 50 s、95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃30 s，合計35個循環?；虻南鄬Ρ磉_量用2-△△Ct方法計算，所用引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.5 MTS實驗將轉染24 h后的Eca109細胞接種于96孔板中，每孔1×103個細胞，每組設6個副孔。待細胞貼壁后分別于0、24、48、72、96 h，每孔加入20 μL的MTS試劑(500 μg/mL)。震蕩混勻后，細胞于培養箱中孵育2 h，隨后將96孔板置于多功能酶標儀中測定490 nm處的吸光度值，實驗重復3次。

1.6 劃痕愈合實驗實驗開始前在6孔板背面均勻繪制水平橫線，將轉染24 h后的Eca109細胞重新接種于6孔板中，每孔1×106個細胞，每孔加入無血清RPMI 1640培養基至2 mL。待細胞長至完全融合時，用200 μL移液槍頭垂直于橫線輕輕劃痕；分別于劃痕后0、24 h在倒置顯微鏡下(100×)觀察細胞，計算劃痕愈合率；實驗重復3次。

1.7 Transwell侵襲實驗將50 μL稀釋好的Matrigel基質膠，均勻涂于Transwell小室的上室表面，37 ℃孵育過夜。細胞轉染24 h，向小室的上室內加入1×105個細胞，再加入無血清RPMI 1640培養基，總量為200 μL；下室內加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基600 μL。常規培養24 h，取出小室，PBS沖洗3次，使用棉簽輕柔地擦去上室內未能穿透膜的細胞，結晶紫染色、固定在倒置顯微鏡下觀察，并計算穿膜細胞數，實驗重復3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗采用生物信息學分析預測NRSN2-AS1序列中可與miR-129-5p相結合的片段，并將該片段插入至雙熒光素酶報告基因載體pmir GLO中，構建NRSN2-AS1野生型和突變型質粒。將NRSN2-AS1野生型和突變型質粒，分別與miR-129-5p-mimic共轉染至Eca109細胞，常規培養48 h，使用雙熒光素酶報告基因試劑盒測定各組的相對熒光強度；實驗重復3次。

為測定Wnt/β-catenin信號通路激活情況，將TOP-FLASH、FOP-FLASH、空白對照質粒，分別與pcDNA3.1-NRSN2-AS1質粒、miR-129-5p-mimic共轉染至Eca109細胞。常規培養48 h，使用雙熒光素酶報告基因試劑盒測定TOP/FOP比值；實驗重復3次。

2 結果

2.1 ESCC中NRSN2-AS1的表達qRT-PCR結果顯示，NRSN2-AS1在ESCC組織(2.48±0.90)中的表達水平顯著高于癌旁組織(1.02±0.73，t=4.480，P<0.01，圖1)。

圖1 ESCC組織及癌旁組織中NRSN2-AS1的表達

2.2 ESCC細胞系中NRSN2-AS1的表達隨機選取10例ESCC癌旁組織的cDNA，混合后作為對照組(Pool)。qRT-PCR檢測顯示：NRSN2-AS1在ESCC細胞系Eca109(1.99±0.04)、TE1(2.43±0.09)、TE13(3.68±0.21)和KYSE150(4.44±0.26)中的表達水平顯著高于對照組(1.00±0.08)(P均<0.01，圖2)。由于NRSN2-AS1在Eca109細胞中表達相對較低，故選擇其用于后續過表達實驗。

圖2 ESCC細胞系中NRSN2-AS1的表達

2.3 NRSN2-AS1過表達的效率本實驗在Eca109細胞中轉染pcDNA3.1-NRSN2-AS1，采用qRT-PCR法檢測過表達效率。與轉染pcDNA3.1-NC組中NRSN2-AS1(1.01±0.13)相比，轉染pcDNA3.1-NRSN2-AS1組中NRSN2-AS1(44.98±3.30)的表達水平顯著提高(t=18.826，P<0.01)。

2.4 NRSN2-AS1過表達對Eca109細胞增殖的影響MTS結果顯示，與pcDNA3.1-NC組相比，pcDNA3.1-NRSN2-AS1組中NRSN2-AS1過表達可促進Eca109細胞的增殖能力(P<0.01，圖3)。

圖3 MTS檢測NRSN2-AS1過表達對Eca109細胞增殖的影響

2.5 NRSN2-AS1過表達對Eca109細胞遷移及侵襲的影響劃痕愈合實驗結果顯示，轉染pcDNA3.1-NRSN2-AS1組Eca109細胞的劃痕愈合率(69.03%±4.11%)顯著高于pcDNA3.1-NC(82.12%±3.08%)(t=12.651，P<0.01，圖4A)。Transwell侵襲實驗結果顯示，轉染pcDNA3.1-NRSN2-AS1組Eca109細胞的穿膜細胞數(618.52±7.78)顯著高于pcDNA3.1-NC(467.51±3.54)(t=22.667，P<0.01，圖4B)。實驗結果表明，NRSN2-AS1可顯著提高Eca109細胞的遷移及侵襲能力。

圖4 Eca109細胞遷移、侵襲能力檢測：A.劃痕愈合實驗檢測NRSN2-AS1過表達對Eca109細胞遷移能力的影響；B.Transwell侵襲實驗檢測NRSN2-AS1過表達對Eca109細胞侵襲能力的影響：1.pcDNA3.1-NC組;2.pcDNA3.1-NRSN2-AS1組

2.6 生物信息學預測NRSN2-AS1的靶基因及實驗驗證使用RNA22數據庫預測發現， NRSN2-AS1的3’UTR區存在miR-129-5p的結合位點，并將3’UTR區的結合位點進行點突變(圖5)。qRT-PCR結果顯示，pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-NRSN2-AS1組中miR-129-5p的表達量分別為1.02±0.03和0.62±0.06，NRSN2-AS1過表達可顯著下調miR-129-5p的表達(t=9.812，P<0.01，圖6A)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-129-5p-mimic可顯著降低NRSN2-AS1野生質粒的熒光活性(t=23.273，P<0.01，圖6B)，但對NRSN2-AS1突變質粒的熒光活性無明顯影響(P>0.05)；提示NRSN2-AS1可靶向調控miR-129-5p的表達。

圖5 生物信息學預測NRSN2-AS1的靶基因

圖6 NRSN2-AS1的靶基因：A.qRT-PCR檢測Eca109細胞中NRSN2-AS1過表達對miR-129-5p表達的影響；B.雙熒光素酶報告基因實驗驗證NRSN2-AS1與miR-129-5p的靶向調控關系

2.7 生物信息學預測NRSN2-AS1/miR-129-5p軸下游機制及實驗驗證采用StarbaseⅤ3.0數據庫對miR-129-5p的下游靶基因進行KEGG富集分析，結果顯示：Wnt/β-catenin信號通路可能是miR-129-5p的下游作用靶點(圖7)。TOP/FOP雙熒光素酶報告基因結果顯示，miR-129-5p-mimic轉染后可降低TOP/FOP熒光素酶活性(t=16.053，P<0.01，圖8A)，而NRSN2-AS1過表達可顯著增強TOP/FOP熒光素酶活性(t=10.473，P<0.01，圖8B)。TargetScan數據庫預測結果表明，miR-129-5p與Wnt5a的3’UTR區存在結合位點(圖9)。qRT-PCR結果顯示，miR-NC組和miR-129-5p-mimic組中Wnt5a的表達量分別為1.01±0.04和0.66±0.02，miR-129-5p過表達可降低Wnt5a的表達水平(t=10.291，P<0.01，圖10A)；而pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-NRSN2-AS1組中Wnt5a表達量分別為1.00±0.05和1.48±0.06，NRSN2-AS1過表達可上調Wnt5a的表達水平(t=7.882，P<0.01，圖10B)。結果表明：NRSN2-AS1可通過靶向調控miR-129-5p/Wnt5a軸激活Wnt/β-catenin信號通路。

圖7 miR-129-5p的下游靶基因的KEGG富集分析

圖8 miR-129-5p過表達(A)和NRSN2-AS1過表達(B)對Wnt/β-catenin信號通路的影響

圖9 生物信息學預測miR-129-5p的靶基因

圖10 miR-129-5p過表達(A)和NRSN2-AS1過表達(B)對Wnt5a表達的影響

3 討論

ESCC屬于侵襲性和病死率均較高的惡性腫瘤，由于其早期癥狀不明顯，多數患者發現時已為中晚期[10]。因此，探索ESCC的發病機制并尋找新的潛在治療靶點，有助于提高ESCC患者的生存率。近年隨著對lncRNA的相關研究不斷深入，發現其異常表達與惡性腫瘤的形成及進展密切相關[11]。例如lncRNA MALAT1在肺癌、胰腺癌、直腸癌等多種腫瘤中表達上調，并可促進腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲[12-13]。lncRNA NRSN2-AS1作為新近發現的長鏈非編碼RNA，位于人類染色體20p13。目前，NRSN2-AS1在ESCC中的表達及相關分子機制尚未見報道。

本組發現NRSN2-AS1在ESCC組織和細胞系中均呈高表達，為進一步了解NRSN2-AS1在ESCC中的生物學作用，本組構建了NRSN2-AS1過表達的ESCC細胞。體外功能實驗表明，NRSN2-AS1可促進ESCC細胞的增殖、遷移及侵襲。以上結果提示，NRSN2-AS1可能在ESCC的發生、發展中發揮促癌基因的作用。

在作用機制上，lncRNA可作為競爭性內源RNA與相應miRNA結合發揮調控作用[14-15]。本實驗證明，NRSN2-AS1可靶向調控miR-129-5p的表達。大量研究結果表明，miR-129-5p在多種腫瘤中呈低表達，發揮抑癌基因的作用。在ESCC中miR-129-5p可通過下調Cyclin D1的表達抑制腫瘤進展[16-18]。本組通過實驗進一步驗證了Wnt5a是miR-129-5p的下游靶基因。Wnt5a是Wnt蛋白家族的成員，Wnt5a的表達上調可激活Wnt/β-catenin信號通路。本組應用TOP/FOP雙熒光素酶報告基因發現，NRSN2-AS1通過靶向調控miR-129-5p/Wnt5a軸激活Wnt/β-catenin信號通路。本組結果與NRSN2-AS1在卵巢癌中的作用機制一致[9]。Wnt/β-catenin信號通路在人類多種惡性腫瘤中被激活，在腫瘤細胞的遷移侵襲、抗凋亡及化療耐藥等方面的調控發揮重要作用[19-20]。在ESCC中Wnt/β-catenin信號通路激活后可刺激β-catenin的核移位，促進下游靶基因Cyclin D1和C-myc的表達，進而導致腫瘤細胞的惡性增殖，從而促進腫瘤發生、發展[21]。

綜上所述，NRSN2-AS1在ESCC組織及細胞中呈高表達，NRSN2-AS1可通過靶向調控miR-129-5p激活Wnt/β-catenin信號通路促進ESCC細胞的增殖、遷移及侵襲，提示NRSN2-AS1在ESCC的發生、發展中起重要作用，有望成為潛在的治療靶點。