甲狀腺乳頭狀癌中環狀RNA_0015278的表達及臨床意義

丁華杰，楊紹石，李 莎，史華寧，龔 雪，王小杰

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinom, PTC)是常見的惡性腫瘤，其發病率有逐年上漲趨勢，已成為女性第五大常見腫瘤。PTC預后良好，局部5年生存率達95%以上，但遠處轉移患者的5年生存率約50%。此外，長期隨訪中發現25%的PTC患者復發[1]。因此，迫切需要尋找新的腫瘤標志物來監測PTC的發生、發展，以提高對其的診斷、治療及遠期監測。環狀RNA(circRNA)屬于非編碼RNA，通過海綿狀微小RNA和調節RNA結合蛋白調節各種生物學過程[2-3]。最新研究表明，circRNA可以通過調節各種信號來調節癌癥的發病機制及進展[4-5]。circRNA被認為是潛在的臨床腫瘤生物學標志物，其活性穩定、易于提取[6-7]。有研究表明：circ_0002111、circ_0006156和circ_0137287作為臨床腫瘤標志物，具有改善PTC患者管理的潛力[8-10]。Circ_0015278是新近發現的circRNA，可以抑制幾種腫瘤的進展，包括非小細胞肺癌和卵巢癌[11-12]。本文旨在探討circ_0015278對PTC的診斷價值及與臨床病理特征的關系，為其臨床診斷及預后評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年12月承德醫學院附屬醫院經甲狀腺手術切除的206例PTC及癌旁組織；收集患者年齡、性別、腫瘤大小、有無甲狀腺外侵、病理性T期(pT)、病理性N期(pN)、病理性TNM期(pTNM)、輔助放射性碘治療等。篩選標準：(1)手術切除的腫瘤組織及癌旁組織保存良好，可用于RNA分離，主要臨床病理資料完整。(2)術前均未接受PTC治療，均無其他惡性疾病史。

1.2 qRT-PCR法應用qRT-PCR檢測PTC及癌旁組織中circ_0015278的表達。每個樣品的qRT-PCR重復檢測3次，循環條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，合計40次循環。qRT-PCR中使用以下試劑盒：TRIzol試劑(美國Thermo公司)、RNase R iScript cDNA合成試劑盒(隨機引物)(美國Bio-Rad公司)、QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒(德國QiaGen公司)。GAPDH作為內控基因被分離。使用2-ΔΔCt方法計算circ_0015278的相對表達。circ_0015278正向引物：5′-TGGCTGTGGCTGTGTTAGG-3′，反向引物：5′-TTCATT GGTCTGTGGATCATATCG-3′；GAPDH正向引物：5′-GACCA CAGTCCATGCCATCAC-3′，反向引物：5′-ACGCCTGCTTCAC CACCTT-3′。

2 結果

2.1 臨床特征206例PTC患者中，男性50例(24.3%)，女性156例(75.7%)；平均年齡(43.9±11.3)歲。腫瘤平均最大徑為(3.5±1.6) cm，84例(40.8%)有甲狀腺外侵，122例(59.2%)無甲狀腺外侵。pT1期29例(14.1%)，pT2期62例(30.1%)，pT3期55例(26.7%)，pT4期60例(29.1%)。pN0期69例(33.5%)，pN1期137例(66.5%)。pTNM分期：Ⅰ期111例(53.9%)，Ⅱ期16例(7.8%)，Ⅲ期47例(22.8%)，Ⅳ期32例(15.5%)。此外，57例(27.7%)患者接受了放射性碘的輔助治療。

2.2 PTC組織中circ_0015278的表達與癌旁組織[1.001(0.750，1.358)]相比，PTC組織中circ_0015278的表達降低[0.342(0.222，0.573)](Z=-14.146，P<0.001，圖1)；ROC生存曲線分析顯示，circ_0015278的表達以0.740為截斷值時，在鑒別PTC和癌旁組織之間具有良好的價值(AUC：0.903，95%CI：0.847～0.932，圖2)。

圖1 PTC及癌旁組織中circ_0015278的表達

圖2 PTC及癌旁組織中circ_0015278的表達ROC曲線

2.3 PTC中circ_0015278表達與臨床病理特征的關系PTC組織中circ_0015278高表達與患者年齡<45歲(b=-0.147，P=0.021)、無甲狀腺外侵(b=-0.134，P=0.036)、低pT分期(b=-0.165，P=0.005)、低pN分期(b=-0.192，P=0.003)和低pTNM分期(b=-0.181，P=0.002)相關。未發現circ_0015278表達與患者性別(b=0.053，P=0.404)及腫瘤最大徑(b=-0.100，P=0.117)相關(表1)。

表1 PTC中circ_0015278表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

3 討論

circRNA作為特殊的非編碼RNA，具有數量眾多、結構穩定及高度保守等特征，能充當微小RNA(microRNA, miRNA)分子海綿、調節基因轉錄、剪接及參加蛋白質的翻譯等。近年研究表明，circRNA作為miRNA海綿通過調節miRNA活性，從而降低miRNA結合和下調蛋白編碼轉錄本的能力[13-15]，參與多種腫瘤的發生、發展等重要生物學功能，成為近年關注的熱點[16]。有研究表明：circ_100290通過miR-29b調控CDK6的表達，促進口腔癌細胞增殖。circ_0052112作為miR-125a-5p的分子海綿，促進乳腺癌細胞的遷移及侵襲。circ_PSMC3通過miR-296-5p海綿，抑制胃癌細胞的增殖與轉移[17-19]。李瑩等[20]報道miR-133在甲狀腺濾泡性癌(follicular thyroid carcinoma， FTC)細胞中表達下調，且與FTC高分期具有相關性，提示miR-133在FTC的發生、發展中可能起重要作用，miR-133在FTC、PTC及結節性甲狀腺腫伴腺瘤中的表達差異有顯著性。最近研究也發現circRNAs異常表達與PTC進展有關[21]，測序分析表明PTC中hsa_circ_0001681(circRNA RAPGEF5或circRNA GEF5)的表達異常增加[22-24]。

近年甲狀腺癌的發病率及復發率迅速增加，盡管臨床治療技術不斷進步，但仍然有較高的發病率及復發率[25]。circ_0015278是新發現的circRNA，可以抑制多種癌癥的進展。在非小細胞肺癌中，circ_0015278過表達通過海綿狀microRNA-1228減少細胞增殖。在卵巢癌中，circ_0015278通過miR-1228/p53/EMT信號抑制細胞增殖和轉移[11-12]。本組206例PTC組織中circ_0015278的表達較癌旁組織減少，circ_0015278高表達可能作為miR-1228的海綿，增強野生型p53的活性(如卵巢癌)，野生型p53是甲狀腺腫瘤發生的關鍵抑制因子[26]。文獻報道circ_0015278的高表達，與非小細胞肺癌患者的淋巴結轉移呈負相關[11]。本組發現PTC組織中circ_0015278高表達與患者年齡、腫瘤大小、甲狀腺外侵、pT分期、pN分期和pTNM分期呈負相關，其中與患者年齡、甲狀腺外侵、pT分期、pN分期和pTNM分期差異有統計學意義(P<0.05)，提示PTC組織中circ_0015278高表達與患者年齡<45歲、無甲狀腺外侵、較低的pT、pN及pTNM分期相關；circ_0015278表達與患者性別及腫瘤大小均無關(P>0.05)。原因如下：(1)circ_0015278可能抑制PTC生長，導致PTC分期降低[27]。(2)circ_0015278可通過海綿狀miR-1228降低PTC細胞的EMT，與無甲狀腺外浸潤及pN0分期有關。(3)circ_0015278可能通過調節miR-1228/p53/EMT信號通路抑制PTC細胞的增殖、遷移和侵襲，從而抑制PTC的進展。因此，在PTC組織中circ_0015278高表達與較低的pTNM分期相關。

本實驗有下列局限性：(1)隨訪時間相對較短，circ_0015278在PTC組織中的預后價值有待進一步分析。(2)僅考察了在PTC組織病理中circ_0015278的臨床價值，而在外周血、尿液等來源RNA的應用價值有待進一步分析。(3)PTC組織中一些circRNAs失調，本組未涉及circ_0015278調控PTC進展的分子機制，有待進一步分析。

綜上所述，circ_0015278在PTC組織中表達減少，其高表達與PTC患者年齡<45歲、無甲狀腺外侵及較低的pT、pN及pTNM分期相關，circ_0015278有望成為改善PTC患者治療及判定預后潛在的腫瘤生物學標志物。