乳腺癌中CREPT的表達及臨床意義

張美智子，陳永良，郭佳雯，吳梓萱，薛 晶

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，最新統計的全球乳腺癌新發病例為226萬，而死亡人數為68萬[1]。中國乳腺癌發病率呈逐年上升趨勢，且發病年齡趨于年輕化，新發病例位居全球首位，患者的經濟負擔也逐年加重[1-2]。目前，乳腺癌主要以手術治療為主，并結合輔助治療手段[3-4]。腫瘤細胞周期相關蛋白(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor, CREPT)也稱RPRD1B，是新發現的位于人類20號染色體的基因，在多種腫瘤中呈高表達[5]?，F階段對于CREPT的研究較多，最新觀點認為CREPT/RPRD1B以p300依賴的方式，通過STAT3驅動基因轉錄促進腫瘤的發生[6]，但尚未有文獻闡明CREPT在乳腺癌發生、發展中的關系。本文著重探討CREPT在乳腺癌中的表達，并分析其與臨床病理特征的相關性，以提高臨床與病理醫師的認識水平。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年11月～2021年6月承德醫學院附屬醫院收治的乳腺癌術后癌組織石蠟標本132例，患者年齡26～73歲，中位年齡49歲；癌旁組織石蠟標本52例，患者年齡30～56歲，中位年齡48歲，隨訪時間為270個月。另收集12對新鮮乳腺癌與癌旁配對組織標本，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?；颊咝g前均未行放、化療等輔助治療，病理分級按WHO(2019)乳腺腫瘤分類進行。本實驗經承德醫學院附屬醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1數據庫 UALCAN數據庫(http:// ualcan.path.uab.edu/)包括31種癌癥類型，通過該數據庫可利用TCGA轉錄組和臨床患者數據，對CREPT基因表達進行深入分析[7]。GEPIA2數據庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/analysis)包括9 736個腫瘤和8 587個正常樣本，可有效進行癌癥數據在線分析和挖掘的網站[8]，分析CREPT基因的表達及與預后的關系。

1.2.2Western blot法 取適量置于-80 ℃冰箱凍存的乳腺癌及配對癌旁組織，加入蛋白酶抑制劑和裂解液(稀釋比1 ∶100，上海碧云天生物公司)，置于冰上操作，充分研磨靜置后放入離心機中，離心3 000 r/min，5 min；使用BCA法測定蛋白質濃度，調整樣品濃度；加入Loading Buffer煮沸10 min。Western blot檢測：配膠，轉膜，裁膜封閉，加入一抗(CE10稀釋比1 ∶500)，TBST洗膜，加入二抗(稀釋比1 ∶1 000)；室溫孵育1 h；洗膜后顯影。Image J軟件進行灰度值分析。

1.2.3qRT-PCR法 取適量置于-80 ℃冰箱凍存的乳腺癌及配對癌旁組織，按照TRIzol說明書提取總RNA，評價RNA純度，根據FastQuant試劑盒(天跟生化公司)說明書合成cDNA第一鏈。PCR引物由上海生物工程公司合成，其中CREPT引物序列：上游5′-TGTCCCTTTGGCTCATCCAC-3′，下游5′-CATCTGCCTCTCTGGCAACA-3′。GAPDH引物序列：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-TGGTGAAGACGACAGTGGA-3′。

1.2.4免疫組化 采用免疫組化EnVision兩步法染色，室溫下經石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，蒸餾水洗3次各3 min，PBS沖洗3次，各5 min，進行抗原修復，將切片放入檸檬酸緩沖液中煮沸，持續20 min；室溫冷卻。PBS沖洗3次，各5 min；加入3%H2O210 min；用PBS沖洗3次各5 min；倒去封閉液，用PBS沖洗3次各5 min，滴加一抗鼠抗CREPT單克隆抗體(3E10，1 ∶100)(由清華大學醫學院常智杰教授贈與)，置于4 ℃過夜，用PBS清洗3次，各5 min；加入二抗(DAKO公司)，室溫下靜置45 min；PBS清洗3次，各5 min；DAB顯色試劑盒(DAKO公司)；蘇木精復染，脫水封固。CREPT染色結果以半定量方法評估，免疫反應性評分(immunoreactivity score, IRS)：低表達組(IRS為0～6分)和高表達組(6～12分)。

2 結果

2.1 GEPIA2及UALCAN數據庫分析利用GEPIA2和UALCAN數據庫分析顯示，CREPT在1 097例乳腺癌、114例正常乳腺組織中的表達差異有顯著性，且CREPT在乳腺癌組織中的表達顯著高于正常乳腺組織(P<0.01，圖1A)。在乳腺癌的臨床病理因素中，CREPT在乳腺癌的各個分期均有表達且分期越高，其表達量越高，差異有統計學意義(P<0.01，圖1B)。檢索UALCAN數據庫發現，CREPT基因高表達組乳腺癌患者總生存期明顯低于低表達組，差異有統計學意義(P=0.032，圖1C)；在不同種族的乳腺癌患者中，CREPT高表達組患者總生存期明顯低于低表達組，差異有統計學意義(P=0.034，圖1D)。

圖1 GEPIA2及UALCAN數據庫分析CREPT在乳腺癌中的表達水平與預后的關系：A.正常乳腺組織與乳腺癌組織中CREPT的表達；B.正常乳腺組織與不同臨床分期的乳腺癌組織中CREPT的表達；C.CREPT的表達對患者生存期的影響；D.CREPT表達在不同種族的乳腺癌患者中的比較

2.2 Western blot法檢測CREPT蛋白表達采用Western blot法檢測顯示：乳腺癌組織中CREPT蛋白表達水平明顯升高(圖2A)；CREPT蛋白在乳腺癌組織中的表達量(0.30±0.01)明顯高于癌旁乳腺組織(0.08±0.07)，兩者差異有統計學意義(P<0.01，圖2B)。

圖2 Western blot法檢測乳腺癌及癌旁組織中CREPT蛋白表達：A.電泳圖；B.直方圖

2.3 qRT-PCR法檢測CREPT相對表達量運用相對定量法通過2-ΔΔCt計算，檢測乳腺癌組織中CREPT mRNA相對表達量(6.321±0.543)明顯高于癌旁組織(1.032±0.32)，差異有統計學意義(P<0.01，圖3)。

圖3 乳腺癌及癌旁組織中CREPT mRNA表達水平

2.4 免疫組化法檢測石蠟切片中CREPT的表達CREPT表達主要定位于細胞核。132例乳腺癌標本中，CREPT表達者132例(圖4A)，其中高表達76例，低表達56例，而在癌旁組織中表達者52例(圖4B)，均為低表達；兩組差異有顯著統計學意義(χ2=51.008，P<0.01)。CREPT的高表達與TNM分期有關及有無淋巴結轉移有關，且差異有統計學意義(P<0.01，表1)。采用Kaplan-Meier法分析105例患者生存狀態，Log-rank檢驗CREPT高表達的乳腺癌患者總生存期較短(P<0.05，圖5)。

AB

圖5 CREPT表達與乳腺癌患者預后的關系

表1 乳腺癌組織中CREPT表達與臨床病理特征的關系

3 討論

含核前mRNA結構域蛋白(regulation of nuclear pre-mRNA-domain-containing RPRD)家族主要成員有p15RS(RPRD1A)、CREPT(RPRD1B)和RPRD2。RPRD家族蛋白質結構包含C末端結構域(carboxy-terminal domain，CTD)，與CTD相互作用的效應蛋白是CTD相互作用域(RNA Pol II CTD interacting domain，CID)[9]。

CID存在于眾多調節轉錄、終止和加工RNA的蛋白質中，介導與RNA聚合酶II(RNAPII)的最大亞單位Rpb1含有CTD的關聯，并在高效合成成熟的mRNA中發揮重要作用。2012年常智杰教授新發現了CREPT基因，表達于大部分人體細胞和組織中，其定位于20號染色體長臂1區1帶[10]。在結構上CREPT除了有RPR結構域外，還有一個卷曲螺旋末端結構域，可以幫助其形成二聚體，進一步加強CID與CTD的相互作用[11]。在功能上包括有促進DNA的修復、調節細胞周期等。最近也有研究發現，沉默CREPT的乳腺癌細胞會降低CDK1的表達，而CDK1是同源重組(homologous recombination, HR)方式中的關鍵效應子。因此，CREPT可能以間接的方式參與HR過程，但存在細胞類型的差異，其具體發生過程仍有待于進一步研究[12]。Yang等[13]發現CREPT缺失的腸上皮細胞在損傷后無法再生的現象，說明CREPT可以調節小鼠腸道干細胞分化分裂相關的基因表達，促進腸道再生對腸上皮細胞的恢復與更新至關重要。

目前，已經在多種類型的腫瘤中均發現CREPT的異常過表達，并且其在調控細胞周期和促進腫瘤生長方面也發揮巨大作用[9]。

有學者發布最新研究指出，CREPT首先與p300形成復合物，然后通過其RPR結構域與STAT3結合，充當p300與STAT3溝通的橋梁，從而增強STAT3轉錄活性，發揮其致癌作用[14]。在結直腸癌(colorectal cancer，CRC)細胞系中發現，CREPT與p300協同作用，增強p300與β-catenin的乙?；饔?，并激活Wnt/β-catenin通路，進而調控腫瘤的發生與發展[15]。此外，細胞周期的失調也是腫瘤發生的共同特點之一。CREPT調節多種細胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶的表達，進而調控細胞周期。其主要是通過增強RNA聚合酶Ⅱ與啟動子的結合，誘導靶基因成環實現。文獻報道CREPT可以促進Cyclin D1、Cyclin E、CDK4、CDK2和CDK6轉錄，即其主要作用集中于G1/S期的過渡[4]。研究發現，胃癌細胞中CREPT經極光激酶B(Aurora B)磷酸化S145位點后，使其RPR域與RNA聚合酶Ⅱ作用，促進Cyclin B1轉錄進而加速G2/M期轉換[16]。

在CRC[15]、胃癌[16]、食管癌[17]、非小細胞肺癌[18]、黑素細胞瘤[19]等15種癌組織中[20]，CREPT的表達含量均高于其癌旁組織。在腎癌組織中，CREPT的表達水平與TNM分期、分級預后緊密相關[21]。在CRC組織中，CREPT高表達促進腫瘤的增長；與良性組織相比，CREPT細胞在CRC組織中大量表達且與腫瘤進展呈正相關[22]，提示CREPT參與多種癌癥發生、發展，促進癌癥的轉移和侵襲。Ma等[23]設計了一種細胞可滲透性肽的PROTAC，可在胰腺癌細胞中降解CREPT；當CREPT被降解，腫瘤細胞的增殖與遷移能力大幅減弱，提示CREPT可能成為解決腫瘤防治問題的新方向。

目前，CREPT在乳腺癌中的作用尚不清楚。近年我國女性乳腺癌發病率及病死率逐年攀升，且發病年齡有低齡化的趨勢，已嚴重危害女性身體健康[24-25]。因此，本實驗分析CREPT在乳腺癌組織中的表達及臨床意義，結合生物信息學技術，通過Western blot法及免疫組化EnVision兩步法檢測CREPT在乳腺癌組織中的表達，實驗結果發現乳腺癌中CREPT的表達明顯高于癌旁組織，且乳腺癌患者的臨床分期越高，CREPT的表達水平也不斷提高。CREPT高表達患者的總生存期明顯低于低表達患者，CREPT的表達水平與乳腺癌分型及有無淋巴結轉移均有關。

總之，CREPT可作為新的原癌基因，參與調控乳腺癌發生、發展，促使乳腺癌向惡性發展。CREPT有望成為乳腺癌分型相關的潛在生物學標志物及治療的新靶點，有助于早期的癌癥篩查和靶向治療。