卵母細胞激活對前次助孕結局不良患者妊娠結局的影響

趙小利，趙正豪，薛俠，賈苗苗，師娟子

(西北婦女兒童醫院生殖中心，西安 710000)

卵胞漿內單精子注射(ICSI)是一項通過顯微操作把單個精子注射到卵母細胞內完成受精的輔助生殖技術。ICSI是目前治療男性嚴重少弱精子癥最有效的技術，其正常受精率可以達到70%。但在ICSI周期中仍會有2%～3%的患者面臨完全受精失敗，經皮睪丸精子抽吸術后卵胞漿內單精子注射(TESA-ICSI)周期中這一比例稍有增加[1]。常見的ICSI受精失敗原因包括卵母細胞缺陷、精子缺陷以及ICSI操作缺陷等[2]。ICSI周期完全受精失敗患者中約有80%是由于精子內激活物質不足，導致卵母細胞未被激活停滯在MⅡ期[3-4]。目前人工卵母細胞激活是治療ICSI部分及完全受精失敗最常用的方法[5]。卵母細胞人工激活(AOA)技術中，AOA離子轉運載體將培養基中的鈣離子和鎂離子通過細胞膜轉運到胞質中，使細胞質中的鈣離子濃度迅速增加，細胞質中高濃度的鈣離子作為一種有絲分裂的信號，促使卵母細胞減數分裂恢復、精子核去濃縮以及雌雄原核形成。卵母細胞激活成功后胚胎繼續發育，卵母細胞激活作為一種級聯現象是胚胎發育的開始[6]。因此，本研究納入前次助孕治療中ICSI受精失敗或受精低下的患者為研究對象，下一治療周期中進行卵母細胞激活，通過回顧性分析納入患者的自身前后對照資料，探討卵母細胞激活是否能改善前次ICSI受精失敗及受精低下患者的妊娠結局。

資料和方法

一、研究對象及分組

選取2015年1月至2021年12月因男方少弱精子癥在西北婦女兒童醫院生殖中心接受ICSI治療、上一周期助孕結局不良的患者為研究對象。少弱精子癥的診斷標準參照WHO第5版《人類精液檢查與處理實驗室手冊》進行。納入標準：(1)兩次周期均為ICSI授精后鮮胚移植；(2)第2周期使用卵母細胞激活治療；(3)兩次周期使用相同的控制性促排卵(COH)方案；(4)男方明確為少弱精子癥患者；(5)女方血清基礎FSH(bFSH)<10 U/L；(6)上一周期存在不同程度的助孕結局不良，包括不同程度的受精障礙，或受精正常但胚胎質量差、未獲得臨床妊娠的患者。排除標準：(1)合并存在子宮內膜異位癥、子宮畸形及其他宮腔病變者；(2)合并卵巢功能衰退或多囊卵巢綜合征等影響卵巢功能疾病者；(3)存在輸卵管積水等輸卵管因素者。

共納入165個周期，根據上一周期ICSI后受精情況進行分組：完全受精失敗或受精率≤30%的患者為受精低下組(n=55)；受精率介于30%～50%之間的患者為受精不良組(n=48)；受精率≥50%且優質胚胎率≤15%的患者為受精正常組(n=62)(該組患者前一周期受精情況較好但胚胎質量差，未獲得臨床妊娠)。受精低下、受精不良及受精正常3組患者在本周期再次行ICSI助孕時均采用與上一周期相同的COH方案，并增加卵母細胞激活處理。同時選擇上一周期常規ICSI助孕后受精正常、女方年齡與受精低下組匹配、未行卵母細胞激活的患者為對照組(按照1∶2的比例納入110個周期)，有再生育需求者本助孕周期采用與前一周期相同的COH方案，仍未使用卵母細胞激活或生長激素(GH)等其他輔助治療。

二、研究方法

1.COH：所有患者均采用本院常規COH方案促排卵，包括長方案以及拮抗劑方案。卵泡期長方案：于前次月經周期前2～4日使用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)(達菲林，益普生，法國)1.8～3.75 mg降調節，給予HMG(麗申寶，珠海麗珠)促排卵，至少兩個卵泡直徑達18 mm及以上時，皮下注射r-HCG(艾澤，默克雪蘭諾，瑞士)250 μg誘發卵母細胞成熟，36 h后超聲引導下經陰道取卵，2 h后去除卵母細胞周圍的顆粒細胞，選取MⅡ卵母細胞行ICSI。拮抗劑方案：于月經周期第2～4日，給予Gn啟動促排卵，當卵泡平均直徑發育至12～14 mm時添加GnRH拮抗劑(GnRH-ant，西曲瑞克，默克雪蘭諾，瑞士)0.25 mg/d，后續扳機時機及取卵操作同長方案。

2.卵母細胞激活：本周期行卵母細胞激活的患者在ICSI后立即將卵母細胞置入含有10 μmol/L鈣離子載體A23187(GYNEMED，德國)的培養皿中20 min，再移入G1培養液(Vitrolife，美國)中充分清洗后置于37℃、6%CO2的培養箱中繼續培養。

3.ICSI-ET：女方取卵日當天行ICSI人工授精。根據女方年齡、身體條件、獲卵數、生殖激素水平、子宮內膜厚度和胚胎質量等因素決定在取卵后第3天(或第5天)行新鮮卵裂胚(或囊胚)移植，優先移植1枚優質卵裂胚或囊胚，年齡>38歲的患者移植2枚胚胎。黃體支持方案為取卵日開始每日肌肉注射黃體酮(浙江仙琚)60 mg，同時每日口服地屈孕酮(雅培，美國)20 mg。胚胎移植后第14天(或囊胚移植后第12天)測血β-HCG；胚胎移植后第28天(或囊胚移植后第26天)行超聲檢測，B超下可見孕囊者即臨床妊娠。孕11周停止黃體支持。

4.觀察指標：比較各組患者上一周期與本周期的一般資料、促排卵情況、胚胎發育情況及妊娠結局?；颊叩囊话阗Y料包括年齡、體質量指數(BMI)、基礎竇卵泡計數(AFC)等；促排卵及胚胎發育情況包括Gn用量、Gn天數、成熟卵子率(成熟卵子數/獲卵總數×100%)、正常受精率(正常受精卵數/成熟卵子數×100%)、可用胚胎率(可用胚胎數/總卵裂胚數×100%)、優質胚胎率(優質胚胎數/總卵裂胚數×100%)、可用囊胚形成率(可用囊胚形成總數/行囊胚培養胚胎數×100%)等；妊娠結局包括臨床妊娠率(臨床妊娠周期數/移植周期數×100%)、活產率(活產周期數/移植周期數×100%)以及早期流產率(≤20周流產周期數/移植周期數×100%)等。

三、統計學分析

結 果

一、各組患者一般資料比較

本研究共納入165個周期，其中受精低下組55個周期，受精不良組48個周期，受精正常組62個周期；對照組110個周期。各組患者中上一周期與激活周期/本周期的女方年齡、BMI、AFC、基礎黃體生成素(bLH)、基礎雌二醇(bE2)、bFSH水平比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、各組患者促排卵情況比較

各組患者中上一周期與激活周期/本周期的Gn起始劑量、Gn總量、HCG日E2及孕酮(P)水平、HCG日內膜厚度比較均無顯著性差異(P>0.05)，獲卵數及卵子成熟率亦無顯著性差異(P>0.05)；僅對照組前后周期的Gn天數、HCG日LH水平比較有顯著性差異(P<0.05)(表2)。

表1 各組患者一般資料比較(-±s)

表2 各組患者促排卵情況比較[(-±s)，%]

續表

三、各組患者胚胎發育情況及妊娠結局比較

1.受精低下組前后周期比較：激活周期的正常受精率、可用胚胎數(率)、優質胚胎數(率)均顯著高于上一周期(P<0.05)，但鮮胚移植后的臨床妊娠率、活產率及早期流產率與上一周期比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

2.受精不良組前后周期比較：激活周期的正常受精率、可用胚胎數(率)、優質胚胎數(率)及可用囊胚形成率均顯著高于上一周期(P<0.05)。鮮胚移植后的臨床妊娠率、活產率亦顯著高于上一周期(P<0.05)；前后周期的早期流產率比較無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

3.受精正常組前后周期比較：激活周期的正常受精率、早期流產率與上一周期比較均無顯著性差異(P>0.05)；但激活周期的可用胚胎數(率)、優質胚胎數(率)、可用囊胚形成率、臨床妊娠率及活產率均顯著高于上一周期(P<0.05)(表3)。

4.對照組前后周期比較：本周期和上一周期的正常受精率、可用胚胎數(率)、優質胚胎數(率)、可用囊胚形成率、臨床妊娠率及活產率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 各組患者胚胎移植情況及妊娠結局比較[(-±s)，%]

續表

討 論

目前人工卵母細胞激活是治療因注射低質量精子導致ICSI受精率低下或完全受精失敗患者最有效的方法[5，7]。人工卵母細胞激活常用的方法包括電刺激、化學處理以及鈣離子載體等。鈣離子載體A23187是目前臨床應用最為廣泛的方法。

反復受精失敗患者的助孕是輔助生殖技術中的難點。近年來，卵母細胞激活應用于反復受精失敗及受精低下患者中的研究越來越多，但其有效性及安全性仍有爭議。Montag等[8]的一項回顧性分析納入前次ICSI受精率<50%的患者89例，結果表明人工卵母細胞激活可以顯著改善前次ICSI受精率<50%患者的受精情況，且對于非卵母細胞因素的完全受精失敗也有較好的治療效果。Fawzy等[9]的一項臨床對照研究中，卵母細胞激活顯著提高了343例反復ICSI受精失敗患者的受精率及臨床妊娠率。而2015年的一篇meta分析納入4組臨床對照實驗進行薈萃分析后，發現卵母細胞激活并不能改善受精低下患者的受精情況及妊娠結局[10]。

目前臨床上對受精低下的定義并不統一，雖然大多數機構認為受精率<30%為受精低下，但也有部分機構將受精低下定義為受精率<40%。為了探討不同程度的受精低下在卵母細胞激活中的受益情況，本研究根據前次ICSI周期不同的受精率進行分組，分析各組患者在使用卵母細胞激活輔助治療后的受精情況、胚胎情況以及妊娠結局。本研究還納入了前一周期受精率≥50%但胚胎質量差的62個周期，探討正常受精的患者是否能受益于卵母細胞激活。且為了消除周期因素，本研究納入的患者前后周期均采取同一COH方案，且未添加GH等其他干預。受精低下組中有9例患者上一周期成熟獲卵數>5枚，但完全受精失??；本周期行卵母細胞激活后均獲得正常受精卵，形成可用胚胎并獲得了良好的妊娠結局；但因為完全受精失敗的樣本數較少，故未單獨分組討論。在受精率≤30%的周期中，卵母細胞激活后其受精率有顯著改善，正常受精率從16.00%提高到了56.93%，可用胚胎率及優質胚胎率也均顯著提高。但可能受限于樣本量不足，本研究中受精率≤30%的周期其可用囊胚形成率及臨床妊娠率并沒有顯著改善，這與Montag等[8]的研究結果并不一致。在30%<受精率<50%的受精不良周期中，正常受精率從43.89%上升到了61.74%，但部分患者的正常受精率并沒有提高，提示有部分患者可能由于卵子因素導致受精不良，卵母細胞激活對其益處并不明顯；且該組患者的胚胎發育潛能及妊娠結局均有顯著改善，尤其是優質胚胎率及可用囊胚形成率顯著提高，提示卵母細胞激活可能在改善胚胎發育潛能上有一定作用，但其生物學機制尚不清楚。在受精率≥50%且優質胚胎率≤15%的周期中，卵母細胞激活不再能顯著改善其受精情況，但其胚胎發育潛能可能受益于卵母細胞激活，該組激活周期的優質胚胎率、可用囊胚形成率顯著增加。Rogers等[11]對卵母細胞激活后胚胎的發育情況進行了研究，發現卵母細胞激活可以提高胚胎質量，促進胚胎向囊胚發育，但其生物學機制尚不明確。在臨床妊娠結局中，由于胚胎質量提高及胚胎數量增加，本研究中各組患者的臨床妊娠率及活產率均有不同程度的增加，但考慮到臨床妊娠及活產所受的影響因素繁多，本研究樣本量較少，故臨床妊娠結局是否受益于卵母細胞激活還需要進一步探討驗證。

目前卵母細胞受精的生物學機制已經非常明確。最早在1994年就有學者將卵母細胞激活應用于ICSI周期，以提高正常受精率。卵母細胞激活是正常受精的重要過程，卵母細胞在成熟分裂促進因子(MPF)和細胞生長抑制因子(CSF)的作用下，發育停滯于第2次減數分裂中期，在精子釋放的精源性卵母細胞激活因子(SOAF)作用下恢復并完成減數分裂。SOAF是精子向卵母細胞釋放的一種或多種可溶性蛋白，目前廣泛接受并明確的關鍵SOAF是磷脂酶C-zeta(PLCζ)?，F在卵母細胞激活不僅用于反復受精失敗以及受精低下的患者，同樣也可用于少弱畸精子癥以及圓頭精子癥等患者[12]。PLCζ的表達減少或消失，被認為是這類患者無法激活卵母細胞的重要因素。大量研究表明精卵結合后，進入卵母細胞的精子會釋放攜帶的可溶性激活因子PLCζ，PLCζ誘導卵母細胞內三磷酸肌醇(IP3)釋放，IP3與內質網上的IP3受體結合后促使大量鈣離子內流形成鈣離子震蕩；卵母細胞內鈣離子震蕩會誘發卵母細胞減數分裂恢復、精子細胞核去濃縮、母體RNA募集、雌雄原核形以及胚胎發育等[13-15]。卵母細胞激活對于受精低下患者的作用已被證實，但其對胚胎發育潛能是否有改善作用尚不清楚。

綜上所述，對于前次ICSI周期由于非卵子因素導致不同程度受精障礙的患者，通過卵母細胞激活技術可以顯著提高受精率，改善胚胎發育潛能；而對于前一周期受精正常但胚胎質量差的患者，卵母細胞激活技術可以明顯改善胚胎發育潛能和臨床妊娠結局。但由于本研究納入樣本量有限，未對移植胚胎數、移植胚胎類型及各組間妊娠結局等資料進行分析，且尚未隨訪新生兒情況，故研究結論可能存在一定偏倚及局限性；后期需要進一步擴大樣本量、完善研究設計進行深入探討以得到更具說服力的結論。