卵母細胞敲除Rictor對紡錘體和早期胚胎發育的影響

劉紅，成艷君，周永紅，李雪梅

(南方醫科大學附屬深圳市婦幼保健院生殖中心，深圳 518017)

卵巢中原始卵泡池大小是女性和大多數哺乳動物生殖壽命的主要決定因素[1]。一般情況下，40歲以上女性原始卵泡池開始出現耗竭，進入卵巢衰竭或更年期。當剩余卵泡數量減少到閾值以下(<1 000個)時，卵泡的正常激活不再發生，發育卵泡停止募集，導致無排卵和閉經[2]。卵巢早衰(POF)是指女性40歲以前出現排卵和卵巢分泌激素功能紊亂和停止的疾病，嚴重危害女性的生育能力[2-3]。全世界約有1%的女性患有POF，誘因主要有自身免疫性卵巢損傷、染色體異?；蚰承┨囟ɑ虻倪z傳異常[4]。雖然FMR1[5-7]、FMR2[7]、FOXL2[8]等基因被認為是導致POF的候選基因，但臨床上大多數病例為特發性病因[9]，發病機制尚不明確，為POF的防治增加了難度。

Rictor蛋白由1 708個氨基酸組成，含約37個磷酸化位點，主要是位于C端區域的絲氨酸或蘇氨酸殘基[10-12]。Rictor可通過AKT依賴和不依賴的方式在細胞增殖、遷移和代謝中起重要作用，進而影響細胞功能[13-15]。研究發現，Rictor對小鼠的胚胎發育至關重要，Rictor缺失會導致小鼠胚胎期死亡[16]。Rictor在小鼠卵巢中分布廣泛，參與卵母細胞減數分裂過程中肌動蛋白的不對稱分裂，對卵母細胞的成熟起決定性作用[17]。然而尚未有研究闡明Rictor在卵泡形成中的作用機制。本課題組已成功構建卵母細胞條件性敲除Rictor基因小鼠模型，該小鼠可出現POF表型[18]，但Rictor如何誘導POF進而導致雌鼠生育能力下降的分子機制不明。因此，本研究擬通過探討Rictor基因敲除對小鼠卵母細胞功能的影響，進一步闡明Rictor在卵母細胞發生和早期胚胎發育中的調控作用，為POF等相關疾病提供新的理論依據和潛在治療靶點。

材料與方法

一、材料

1.小鼠的繁育與基因型鑒定[18]：本研究所需的Zp3-Cre小鼠(Jax編號003650)及Rictorloxp/loxp小鼠均由南方醫科大學陳振國課題組饋贈。獲得卵母細胞條件性敲除小鼠的實驗簡要概述如下：將雄性Zp3-Cre+小鼠與雌性Rictorloxp/loxp小鼠交配，得到Zp3-Cre+，Rictorloxp/WT雄性小鼠，再與Rictorloxp/loxp雌性小鼠回交，獲得Zp3-Cre+，Rictorloxp/loxp雌性小鼠，即為條件性敲除(Rictor-cKO)小鼠(KO組)。取同窩Zp3-Cre-，Rictorloxp/loxp雌性小鼠作為對照組(WT組)。利用免疫組織化學染色驗證敲除效果。在卵母細胞條件性敲除實驗中，攜帶Cre轉基因的雄性(而非雌性)被用于育種，以防止全身性敲除[19]?；蛐丸b定的引物如下，Zp3-F：5’-GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC-3’，Zp3-R：5’-GTGAAAACAGCATTGCTGTCACTT-3’；Rictor-F：5’-GAAGTTATTCAGATGGCCCAGC-3’，Rictor-R：5’-ACTGAATATGTTCATGGTTGTG-3’。所有動物實驗均得到了南方醫科大學動物使用和倫理委員會的批準，并按照該委員會的指導方針和規定進行。

2.主要試劑、耗材與儀器：M2培養基(M7167，Sigma，德國)；含10%血清替代品(SSS，Irvine公司，美國)的人胚胎卵裂培養基(ECM，Irvine公司，美國)；DAB顯色液(中杉金橋)。人絨毛膜促性腺激素(HCG)、孕馬血清促性腺激素(PMSG) 均購自寧波第二激素廠；Rictor 、a/β-Tubulin(2148S) 一抗均購自Cell Signaling Technology(美國)；熒光二抗(111-035-003)購自Jacksonimmuno(美國)。所用培養皿無特殊說明均購自美國康寧公司。Eppendorf Transferman顯微操作系統(德國)；Olympus倒置顯微鏡(日本)。

二、方法

1.卵母細胞獲取及形態評估：取4月齡的雌鼠腹腔注射PMSG(7.5 U/只)，48 h后注射HCG(10 U/只)，13.5 h后脫臼法處死小鼠，剪取輸卵管。在體視鏡下使用注射器針頭劃破輸卵管壺腹部，挑出卵丘卵母細胞復合體(COCs)，用0.3 mol/L的透明質酸酶消化處理，即可獲得卵母細胞。正常第二次減數分裂中期(MⅡ)卵母細胞形態鑒定標準：卵周間隙適中可見第一極體，透明帶光滑無鋸齒狀等異常改變，胞質顆粒均勻無空泡。選取形態較好的卵母細胞轉入人卵裂培養基中，置于37℃、5.8%CO2培養箱中孵育備用。

2.卵母細胞漿內單精子注射(ICSI)[20]：應用顯微操作系統，在M2液滴中進行顯微注射。注射針吸入野生型雄鼠的精子頭，使精子頭位于注射針尖端，固定針固定卵母細胞，將第一極體置于12點或6點，注射針刺入卵母細胞胞質內，緩慢回吸后形成負壓破膜，將精子頭注射入卵母細胞胞質中心區域，稍作停頓退出注射針。注射后的卵母細胞置于人胚胎卵裂培養基中，37℃、5% CO2的培養箱內孵育觀察。

3.卵母細胞減數分裂紡錘體狀態和染色體排列的評價[21-22]：取透明質酸酶脫顆粒細胞處理后的卵母細胞，用酸性的M2培養基去除透明帶并轉移至含1%明膠的載玻片上，于含2%BSA、0.02% Triton-X 100的2%多聚甲醛中固定30 min，用含2%BSA的0.05% Triton-X 100破膜15 min，正常山羊血清37℃封閉1 h，PBS洗3次后加入含2% BSA與0.05% Triton-X 100的兔抗a/β-tubulin(1∶200)一抗，4℃過夜，PBS洗3次后加入含2% BSA與0.05% Triton-X 100的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h。最后用10 μg/L DAPI避光孵育15 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察微管的分布及染色體的排列情況。當卵母細胞減數分裂紡錘體排列松散和/或染色體排列異常以及沒有紡錘體和/或染色體時，定義為紡錘體或染色體異常。

4.觀察指標：包括2PN(精卵原核融合時期)數量、2-細胞胚胎(受精卵第一次有絲分裂)數量和4-細胞胚胎(受精卵第二次有絲分裂)數量。2PN率=2PN數量/注射卵母細胞數×100%；2-細胞胚胎率=2-細胞胚胎數量/2PN數量×100%；4-細胞胚胎率=4-細胞胚胎數量/2-細胞胚胎數量×100%。

三、統計學分析

結 果

一、卵母細胞條件性敲除Rictor基因對小鼠排卵數量的影響

為研究條件性敲除Rictor對雌鼠排卵的影響，課題組成功繁育Zp3-Cre+，Rictorloxp/loxp小鼠(KO組)(圖1A和圖B)，以同窩Zp3-Cre-，Rictorloxp/loxp雌鼠為對照鼠(WT組)，通過注射促性腺激素，觀察條件性敲除小鼠排出的卵母細胞的形態及排卵的數量。結果顯示，KO組的平均排卵數為(14.84±2.64)個(n=6)，對照鼠(WT組)平均排卵數為(15.84±4.92)個(n=6)，差異無統計學意義(P>0.05)(圖1C)；敲除鼠與對照鼠的卵母細胞畸形率亦無顯著性差異(P>0.05)(圖1D)；卵母細胞形態也未見明顯異常(圖1E)。

A：瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型；B：免疫組化驗證敲除效果；C：WT和KO小鼠平均排卵數的比較；D：WT和KO小鼠卵母細胞畸形率的比較；E：WT和KO小鼠卵母細胞形態。

二、卵母細胞條件性敲除Rictor基因對雌鼠受精卵發育影響

為驗證在卵母細胞中敲除Rictor對胚胎發育的影響，我們通過ICSI實驗，將野生型雄鼠的精子頭部注射到敲除鼠的卵母細胞內，以同窩Zp3-Cre-，Rictorloxp/loxp雌鼠為對照鼠(WT組)，觀察受精卵的發育情況。結果顯示，同時段內觀察到的2PN率、發育到2-細胞期胚胎數量均顯著低于對照組(P<0.05)，發育到4-細胞期胚胎數量亦減少(44.4%)，大部分胚胎仍處于2-細胞期卵裂階段，且有少數受精卵發育停滯，未發生卵裂(圖2、表1)。

圖2 卵母細胞敲除Rictor對雌鼠受精卵發育影響

表1 敲除Rictor基因的雌鼠卵母細胞的發育情況(%)

三、卵母細胞條件性敲除Rictor對小鼠染色體的影響

為闡明卵母細胞條件性敲除Rictor后導致胚胎發育遲緩的原因，我們對卵母細胞進行免疫熒光化學染色，檢測Rictor是否影響染色體數量及紡錘絲的形成。結果顯示，卵母細胞條件性敲除Rictor后，卵母細胞的染色體數量正常，但部分卵母細胞的紡錘體形成異常，出現紡錘體排列異常、散亂分布等現象(圖3A)；對照組(WT組)小鼠僅有少部分卵母細胞出現異常(11.57%)，敲除鼠卵母細胞紡錘絲異常錯誤率達到24.43%，差異有統計學意義(P<0.05)(圖3B)。

A：WT(左)和KO(中、右)小鼠卵母細胞紡錘體微管的形態；B：WT和KO小鼠卵母細胞紡錘體微管畸形率的比較。與WT組比較，*P<0.05。

討 論

女性的生殖壽命取決于卵巢原始卵泡池的大小，人類卵巢原始卵泡池的大小通常在胚胎發育期間確定。通過卵泡激活的過程將原始卵泡從休眠卵泡的儲存庫募集到生長卵泡池中，優勢卵泡可發育成熟直至排卵，其余大量卵泡出現凋亡，形成閉鎖卵泡[18]，當原始卵泡池耗竭時，會出現更年期或POF。因此卵泡生長發育對卵巢功能的維持起決定性作用，各種原因引起的卵泡發育受阻或過度耗竭則是導致POF的直接因素[23-24]。卵泡耗竭的發生早于POF癥狀的出現，這也嚴重阻礙了對于POF發生機制的基礎研究。

課題組在前期構建的去氧乙烯基環己烯(VCD)誘導的POF小鼠模型和卵母細胞Rictor-cKO的小鼠模型中發現，Rictor在卵母細胞中對卵泡發育具有保護作用,接受抑制卵母細胞中的Rictor后，卵泡閉鎖加速，卵泡丟失增多[18]。同時，Rictor-cKO小鼠表現出一種全新的POF卵巢表型，其卵泡池和血清雌激素水平均有相似的下降，生育能力在4月齡開始明顯衰退、8月齡時完全不孕。已有研究顯示，Rictor對小鼠的胚胎發育至關重要，Rictor缺失小鼠表現出胎盤功能缺陷和胚胎發育停滯[16，25]。但我們并未在Rictor-cKO小鼠中觀察到相似的胎盤缺陷表型，同時課題組以往研究還顯示，卵母細胞條件性敲除Rictor雌鼠卵泡形成基本正常?；诖?，我們設想Rictor可能通過調控卵泡成熟及受精卵卵裂，從而影響胚胎發育的進程。然而本研究結果顯示：與對照鼠相比，Rictor-cKO小鼠排出的卵母細胞形態無明顯變化，排卵數量以及卵母細胞畸形率也無統計學差異。但是，卵母細胞條件性敲除Rictor會導致受精卵能力減弱，胚胎發育嚴重遲緩。因此，我們推測卵母細胞條件性敲除Rictor可能不影響卵母細胞的形態及數量，但可能對胚胎的正常發育有重要影響。

為深入研究Rictor調控卵母細胞發育的深層機制，闡明Rictor對胚胎早期發育的影響，本研究應用Rictor-cKO小鼠模型，通過對4月齡的雌鼠進行ICSI結合卵母細胞熒光化學染色，試圖發現Rictor對小鼠早期胚胎發育的影響。研究結果顯示，4月齡Rictor-cKO小鼠卵母細胞受精后胚胎發育出現嚴重滯后甚至停滯的現象；同時，免疫熒光染色結果顯示，Rictor-cKO部分卵母細胞的紡錘體排列異常率明顯升高。由此，我們認為卵母細胞條件性敲除Rictor可能會導致卵母細胞的紡錘絲形成異常，進而導致胚胎發育出現停滯或者滯后的現象。但Rictor可能不是導致紡錘絲形成異常的直接因素，Rictor如何影響紡錘絲的組裝機制有待進一步闡明。本研究結果具有廣泛的生理和臨床意義，有助于進一步探討Rictor在調控正常卵巢生理功能中的作用，可能為POF的防治帶來新的理論依據。我們隨后的研究將重點關注Rictor調控正常卵母細胞紡錘絲的形成及誘導早期胚胎發育的分子機制。生理性妊娠過程中，精細的母-胎對話對妊娠成功維持是不可或缺的，胚胎在早期發育時如能在精準時段內向母體發出信號并獲得反應，胚胎才能存活并種植到子宮[26]。目前的研究尚未揭示Rictor是否在母-胎之間的對話中起到積極性的作用。

綜上所述，Rictor對卵母細胞減數分裂過程中紡錘絲的裝配及維持早期胚胎正常發育具有關鍵作用。卵母細胞條件性敲除Rictor引起紡錘絲的排列異常，進而影響胚胎的早期發育。這為我們后續探討Rictor調控卵母細胞形成及胚胎發育的分子機制提供了新依據，也為POF的防治提供了新的理論基礎和潛在治療靶點。