宮頸微生物菌群對IVF-ET妊娠結局的影響

崔媛媛，葉德盛，鄭煒煒，譚穎，馬從順，詹雪君，宋革*

(1.廣東省生殖醫院生殖醫學中心，廣州 510600；2.廣東省生殖科學研究所，廣州 510600；3.國家衛生健康委男性生殖與遺傳重點實驗室，廣州 510600；4.廣州市婦女兒童醫療中心生殖醫學中心，廣州 510623)

自1978年世界上第1例試管嬰兒出生，輔助生殖技術(ART)尤其是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術已成為治療不孕癥的有效手段。垂體降調節藥物使促排卵更高效，胚胎玻璃化冷凍技術大大提升胚胎利用率，臨床妊娠率逐步提高。但事實上，由于胚胎的種植機制仍不明確，即便經過遺傳學篩查胚胎著床率仍較低，孕早期流產率和早產率較高，反復著床失敗患者缺乏有效的臨床治療手段[1]。因此，改善子宮內膜容受性及妊娠結局，成為ART發展的瓶頸。近年研究發現，生殖系統微生物組異常不僅導致生殖道感染和女性不孕癥[2-3]，還與胚胎移植后的妊娠結局有關[4-6]，是改善IVF預后的新突破口。

隨著基因測序技術的發展，借助高通量測序技術對可變區進行測序，結合生物信息學分析，可全面了解機體內的菌群多樣性，同時了解菌群質和量的變化與疾病發生發展的關系，也為了解未知菌屬在疾病中的作用開辟了新的研究方法。本文通過高通量測序技術，研究新鮮取卵周期移植日宮頸微生態菌群對IVF妊娠結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

選擇2020年3—9月在廣東省生殖醫院生殖醫學中心行IVF/ICSI新鮮周期胚胎移植的患者為研究對象，提取其宮頸分泌物作菌群檢測。

納入標準：(1)年齡<35歲；(2)卵泡刺激素(FSH)<10 U/L且抗苗勒管激素(AMH)>1.1 ng/ml；(3)可用胚胎>2個；(4)宮腔鏡檢查排除子宮內膜炎；(5)移植術前3個月內行宮頸黏液檢查，排除衣原體、淋病奈瑟菌感染；一周內行陰道分泌物檢查，排除陰道特異性及非特異性炎癥；無陰道瘙癢、白帶增多等自覺癥狀；(6)取樣前1個月內未使用抗生素；取樣3 d內未行陰道沖洗，無性生活。

排除標準：(1)女方急慢性宮頸炎；(2)子宮畸形、宮腔粘連、子宮黏膜下肌瘤、子宮內膜息肉、子宮腺肌癥、子宮內膜異位癥、輸卵管積水；(3)合并抗磷脂綜合征、甲狀腺功能異常、糖尿病等嚴重系統性疾??；(4)有復發性流產、反復著床失敗病史。

所有研究對象均簽署書面知情同意書。本研究已獲得廣東省生殖醫院醫學倫理委員會批準(倫理審查號：論審研第[2019](25)號)。

本研究共收取標本33例，其中活產17例，生化妊娠1例，流產2例，未孕13例，選取活產及未孕患者共30例進行分析。

二、研究方法

1.IVF/ICSI-ET治療：采用長方案或拮抗劑方案，常規劑量啟動(150～300 U)，定期監測排卵，根據卵泡生長情況及激素水平適當調整促排藥物劑量。當1個卵泡直徑≥18 mm或3個卵泡直徑≥17 mm 時，注射重組人絨毛膜促性腺激素(HCG，艾澤，默克雪蘭諾，德國)或/和GnRH-a(達菲林，博福-益普生，法國)扳機，36～37 h后取卵。取卵后予黃體酮(浙江仙琚) 60 mg/d 肌肉注射黃體支持，3～5 d后行胚胎移植。移植后予地屈孕酮(達芙通，雅培，荷蘭) 30 mg/d + 黃體酮凝膠(雪諾同，默克雪蘭諾，德國) 90 mg/d 黃體支持。移植后12 d抽血查β-HCG，生化妊娠者(HCG>5 U/L)繼續黃體支持。移植28 d后行陰道B超檢查可見宮內孕囊確定為臨床妊娠，臨床妊娠者黃體支持至孕10～11周。按常規流程進行隨訪。

2.標本采集：患者均于胚胎移植手術時留取宮頸管分泌物標本。清潔外陰，消毒鋪巾，窺陰器撐開陰道，無菌棉球擦拭宮頸表面，用干燥無菌棉簽插入宮頸管內轉動10圈，待棉簽吸取分泌物后，取出棉簽放入干燥無菌管，折斷尾部。取樣過程中，棉簽避免接觸陰道口及陰道壁，以防發生標本污染。所有研究對象的取樣和移植均為同一操作者。

3.宮頸微生物菌群的檢測：(1)宮頸細菌總DNA提?。翰捎肞owerSoilDNA分離試劑盒提取宮頸棉簽上的細菌總DNA，分離出的總DNA含量通過PicoGreen DNAassay(Invitrogen)進行定量檢測，并按純化試劑盒說明進行純化；(2)16S rRNA基因高可變區V3-V4高通量測序：使用PCR引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對總DNA中的16S rRNA V3-V4區域進行PCR擴增(TransStartFastPfu DNA Polymerase)，并使用Illumina MiSeq平臺進行測序；(3)生物信息學分析：使用QIIME進行生物信息學分析。根據OTU分類鑒定結果，獲得樣本在界、門、綱、目、科、屬、種水平的具體組成和豐度。后續分析包括聚類分析、Alpha多樣性、Beta多樣性分析、顯著性差異分析、線性判別分析及相關性熱圖。

三、統計學分析

結 果

一、患者基本情況比較

本研究共納入患者30例，其中未孕組13例，活產組17例。兩組患者年齡、不孕年限、BMI、基礎FSH、竇卵泡數(AFC)、原發不孕比例及不孕因素差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本情況比較[(-±s)，n(%)]

二、患者促排卵及胚胎發育情況比較

兩組患者促排卵方案、受精方式、平均Gn用量、HCG日P水平、HCG日內膜厚度、獲卵數、可用胚胎數、優胚數、移植胚胎數及移植優胚數比較均無統計學差異(P>0.05)，活產組Gn天數及HCG日E2水平均顯著高于未孕組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者促排卵及胚胎發育情況比較[(-±s)，n(%)]

三、兩組患者的宮頸微生物組成

1.菌群多樣性分析：兩組樣本共檢測出有效序列數2 349 161條。以序列數與物種數或多樣性指數構建稀釋曲線。Alpha多樣性是對樣品中物種多樣性的分析，包含物種的豐富度和均勻度兩個方面。其中，Chao1估計菌落中包含物種的數目；Good’s_coverage代表微生物覆蓋率；Shannon指數表示物種多樣性。各個標本多樣性物種含量經秩和檢驗，兩組宮頸菌群在物種豐富度和均勻度方面比較均無統計學差異(圖1 A～F)。

采用Beta多樣性對兩組生物多樣性進行比較。Beta多樣性指不同群落之間的物種差異，通過計算樣品間的距離矩陣，觀察樣本間差異。本文采用PCA主成分分析觀察樣本之間的差異，數據顯示兩組患者宮頸微生物菌群組成成分有統計學差異(P=0.002)；通過UPGMA層次聚類分析，直觀顯示不同組中的微生物進化的差異程度較小(P=0.1)(圖1 G～H)。

A：Chao1指數稀釋曲線；B：Chao1指數小提琴圖；C：Goods_coverage稀釋曲線；D：Goods_coverage指數小提琴圖；E：Shannon指數稀釋曲線；F：Shannon指數小提琴圖；G：Beta多樣性PCA分析；H：UPGMA層次聚類分析。N：未孕組；P：活產組。

2.兩組物種豐度聚類分析及組間菌群門、科、屬、種水平差異：根據feature結果和各樣品feature特征表，獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表，并對兩組間物種組成及差異進行分析。選取豐度最高的30個物種分類，將每組在門、屬的相對豐度以氣泡圖形式展現。采用熱圖展示兩組在門-科-屬-種水平上菌群結構不同(圖2)。

菌門水平，共檢測到25種，相對豐度在1%以上共4種，為厚壁門、變形桿菌門、放線菌門、擬桿菌，占宮頸樣本微生物總數的90%以上。

科水平，活產組相對豐度最多的為乳桿菌科(67.34%)、雙歧桿菌科(9.99%)、莫拉菌科(2.94%)；未孕組豐度最多的為乳桿菌科(58.40%)、雙歧桿菌科(9.26%)、假單胞菌科(4.64%)，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

屬水平，活產組相對豐度最多的為乳桿菌屬(67.33%)、加德納菌屬(9.90%)、不動細菌屬(2.76%)；未孕組相對豐度最多的為乳桿菌屬(58.40%)、加德納菌屬(8.84%)、假單胞菌屬(4.64%)、大腸桿菌志賀氏菌屬(2.76%)。兩組患者主導菌群均為厚壁門乳桿菌屬，活產組乳桿菌屬豐度較高，但兩組差異無統計學意義(P>0.05)。

種水平，兩組主導菌群差異顯著?；町a組豐度最高的分別為卷曲乳桿菌(43.71%)、惰性乳桿菌(13.90%)、陰道加德納菌(6.81%)、詹氏乳桿菌(3.55%)、未培養的乳桿菌(3.19%)；未孕組為惰性乳桿菌(50.29%)、陰道加德納菌(6.90%)、卷曲乳桿菌(3.86%)、假單胞菌(3.37%)、未分類的志賀氏菌(2.83%)。兩組比較，卷曲乳桿菌和惰性乳桿菌相對豐度差異有統計學意義(P<0.05)。

采用線性判別分析(LEfSe)方法對兩組患者宮頸微生物群進行分析，共發現7個生物標記物，包括屬水平2個，種水平5個。其中，活產組生物標記物主要有種水平的卷曲乳酸桿菌和奧爾塞內拉菌，未孕組生物標記物有胃瘤球菌屬、理研菌屬，種水平有惰性乳桿菌、未識別的胃瘤球菌、里肯內拉菌及未識別的里肯內拉菌。

3.環境因素相關性分析：為研究環境因素與宮頸微生物群的影響，采用Spearman秩相關系數分析各組不孕類型、年齡、AFC、基礎FSH、促排卵方案、HCG日E2水平、Gn天數等環境因素對胚胎移植日宮頸菌群屬、種相對豐度最多的10種菌群的關系。結果顯示，屬水平，乳桿菌屬相對豐度與各環境因素無相關性，韋榮球菌屬和鏈球菌屬相對豐度與促排卵天數正相關(P<0.05)；種水平，優勢菌群惰性乳桿菌與促排卵天數負相關(P<0.05)，未培養的乳桿菌與BMI負相關(P<0.05)。其他非優勢菌群中，AY-2011-RS11假單胞菌與促排卵方案相關(P<0.01)；HCG日雌激素水平與屬、種水平豐度前十位菌群均無相關性(圖3)。

A：兩組菌群氣泡圖；B：兩組門水平熱圖分析；C：兩組科水平熱圖分析；D：兩組屬水平熱圖分析；E：兩組種水平聚類分析；F：種水平主要菌群詹氏卷曲乳桿菌、惰性乳桿菌兩組的相對豐度；G：兩組經線性判別分析(LEfSe)有顯著性差異的物種。N：未孕組；P：活產組

A：環境因素與宮頸微生物群屬水平相對豐度前10位菌群相關性熱圖；B：環境因素與宮頸微生物群種水平相對豐度前10位菌群相關性熱圖。

討 論

人體不同部位的菌群(例如腸道/呼吸道/皮膚及陰道等)與多種疾病的發生發展密切相關[7]，現已成為新的研究熱點。生殖系統的微生物約占人體總菌群的9%。女性正常陰道菌群中，以不同類型的乳酸桿菌為主，還寄生了雙歧桿菌、擬桿菌、腸球菌、鏈球菌、加德納菌等多種細菌，以及支原體、假絲酵母菌等，它們相關制約、相互作用，共同構成陰道微生態環境[8]。同時，陰道微生物隨月經周期變化而改變，在排卵期和黃體中期豐度最高[9]。生殖系統的微生態平衡對女性生育能力影響顯著，菌群紊亂引起生殖系統的炎癥，不僅可能導致不孕[2]，還與子宮內膜容受性、早期妊娠維持、早產等有關[5，10-11]。

絕大多數學者認為，測序技術發現的陰道-宮頸及子宮內膜的微生物菌群異常對胚胎移植的妊娠結局產生不可忽視的影響[12]。陰道主要菌群為非乳桿菌更容易出現反復著床失敗、子宮內膜炎及復發性流產。付敏等[6]留取移植日陰道分泌物，發現不明原因反復著床失敗患者陰道微生物多樣性增加，表現為乳桿菌豐度降低，而陰道乳酸桿菌占主導者具有較高的臨床妊娠率。Moreno等[4]采用基因芯片測定內膜容受期宮腔內菌群進行分析，發現在容受期內膜菌群高度穩定，乳酸桿菌為優勢菌群組有更好的臨床妊娠結局。

對于一般人群，生殖道微生物群分析能否預測IVF/ICSI-ET妊娠結局，目前尚存有爭議。2012年Hyman等[13]將高通量測序技術用于IVF周期內患者陰道菌群檢測，發現移植日陰道菌群會影響IVF妊娠結局。2017年Franasiak團隊[14]發現，移植管尖端乳酸桿菌占優勢的患者臨床妊娠結局并沒有出現顯著性增高。目前大部分文獻報道以陰道取樣標本為主，但從胚胎移植手術的操作流程考慮，宮頸內菌群在移植過程中會被直接帶入宮腔。因此，本研究選擇年輕(<35歲)、可用胚胎>2個、無反復種植失敗病史的預后良好患者作為研究對象，分析其宮頸微生物菌群與臨床妊娠結局的相關性。研究結果顯示，活產組與未孕組在門、屬水平均以乳桿菌為優勢菌群，其中活產組的屬水平乳桿菌相對豐度較高，但兩組差異無統計學意義(P>0.05)；未孕組患者在胃瘤球菌屬、理研菌屬等異常菌群顯著增加，這與Chen等[15]研究結果相似。Chen等[15]研究發現，在IVF/ICSI治療過程中，妊娠組和未孕組厚壁門、乳桿菌屬等優勢菌群差異無統計學意義，乳桿菌屬在患有子宮內膜炎妊娠組和未孕組比較仍無差異；菌群異常主要體現在非優勢菌群，如放線菌屬、酸桿菌屬等。以上研究均提示，在一般人群，乳酸菌屬優勢菌群并不是正常生殖道微生物群和良好妊娠結局的保障。

在種水平，本研究結果證實，一般人群中乳桿菌在種水平上的變化對妊娠有一定的預測作用?；町a組以卷曲乳桿菌為主要生物標記，未孕組則以惰性乳桿菌為主要生物標記，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。荷蘭學者在303例接受IVF/ICSI治療的女性陰道菌群研究中得出相同的結論，該研究結果顯示，卷曲乳桿菌為優勢菌群是預測妊娠的重要指標[16]。在生育期，高水平的雌激素和孕激素維持乳酸桿菌在陰道內占優勢：雌激素使陰道上皮細胞內糖原蓄積，孕激素促進上皮細胞脫落，釋放糖原。乳酸桿菌將糖原分解為乳酸，維持正常陰道內酸性環境，抑制其他細菌繁殖。然而，不同乳桿菌的作用完全不同。卷曲乳桿菌可抑制多種陰道致病菌的黏附和增殖，在健康女性陰道中相對豐度高，卷曲乳桿菌的缺失與菌群失調有密切關系[17]。研究表明，卷曲乳桿菌基因序列中包含了抑制陰道加德納菌的蛋白基因，并且可以產生抑菌物質抑制白色假絲酵母菌生長以及菌絲形成[18]。而惰性乳桿菌很少與其他乳桿菌共存，容易被細菌取代，在陰道菌群失衡后大量繁殖而成為優勢菌群。大多數研究認為，惰性乳桿菌的增多與亞健康狀態有關，惰性乳桿菌為優勢菌增加了患細菌性陰道病及衣原體的易感性[3，17-19]。異常菌群的存在可能通過宮腔炎性反應及影響內膜容受性等方式影響胚胎著床[20]。

本研究中，兩組患者在促排卵天數及HCG日E2水平上有顯著差異，而相關性分析表明環境因素對屬水平上的優勢菌群無明顯相關性。2008年Jakobsson等[20]首次用16s RNA測序法研究降調周期促排卵期間陰道菌群變化，結果顯示陰道優勢菌群保持相對穩定，僅少部分菌群在促排卵過程發生變化。Zhao等[21]研究發現，不孕女性在促排卵前后陰道菌群無顯著變化。以上結果提示生殖道菌群在個體中保持相對穩定性，促排卵前菌群測定對預測IVF/ICSI治療結局仍有意義[16]。在種水平上，促排卵天數與惰性乳桿菌有相關性。既往研究表明，促排卵天數對妊娠結局無影響[22]，由于本研究樣本量較小，仍需進一步擴大樣本量分析環境因素對惰性乳桿菌種相對豐度的影響。

綜上，本文首次采用16s rRNA測序方法研究新鮮周期胚胎移植日宮頸微生態，針對預后良好的一般患者展開研究。研究表明，宮頸菌群中優勢菌群多為厚壁屬乳桿菌，活產組與未孕組在菌群豐富度及均勻度上無顯著差異，但在物種分布上有顯著差異。卷曲乳桿菌為優勢菌群可能是預測分娩的重要指標，而惰性桿菌為優勢菌群則與著床失敗有關，其可能原因為菌群失調導致的免疫紊亂。由于本文關注的為預后良好人群，且研究樣本量有限，因此宮頸菌群是否影響新鮮周期胚胎移植妊娠結局尚需擴大樣本量進一步研究。本研究結論不適用于特殊人群，或者凍融胚胎移植周期。