加壓毛細管電色譜分離氫溴酸樟柳堿等三種生物堿類成分*

張瀟晗，張曉蕾，牛麗穎,2,3，畢曉東,2,3

(1 河北中醫學院，河北 石家莊 050091；2 河北省中藥配方顆粒創新中心，河北 石家莊 050091；3 河北省中藥材品質評價與標準化工程研究中心，河北 石家莊 050091)

氫溴酸樟柳堿作為M膽堿受體阻斷劑, 具有較強的中樞和外周抗膽堿活性, 能夠解除血管痙攣[1], 改善微循環, 還有平喘、解痙、散瞳、抑制唾液分泌、對抗有機磷中毒、抑制血小板活性等作用, 其安全性高于其他同類藥物，將樟柳堿的氫溴酸鹽作為臨床用藥, 研究開發得到的包括注射液、片劑等劑型也已成功應用于臨床[2]。氫溴酸樟柳堿是天然提取的托品烷類生物堿，存在莨菪堿、山莨菪堿和阿托品等結構類似的活性物質，在藥物分析中需要進行分離和鑒別。常用的分析方法有薄層色譜、電泳、液相色譜等方法，本實驗采用新型高效環保的加壓毛細管電色譜法[3-4]，對氫溴酸樟柳堿等三種生物堿類成分進行分離。

1 實 驗

1.1 儀器試劑

TriSepTM-2100加壓毛細管電色譜，上海通微分析技術有限公司；UV-2102PC 型紫外-可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；超聲波清洗器；旋渦混合器；濾頭，注射器；純水機。

氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿標準品(純度)；甲醇(分析純);乙腈(色譜純)；實驗用水為RO級別用水;所有試劑和溶液在進樣器前都需要用0.2 μm濾膜過濾，流動相需超聲除氣。

1.2 實驗方法

準確稱取氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿標準品4 mg，置離心管中，加適量甲醇溶解，配置成2 mg/mL的氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿的標準儲備液，超聲10 min，備用。精密吸取三種標準儲備液各200 μL于3個離心管中，加甲醇1800 μL，用旋渦混合器震蕩搖勻，作為標準品溶液。精密吸取三種標準儲備液各100 μL于1個離心管中，加甲醇2700 μL，用旋渦混合器震蕩搖勻，作為混標。

pCEC-UV色譜條件，毛細管填充柱(EP-100-20/45-3-C18，內徑 100 μm，總長度 45 μm，有效長度20 cm，ODS填料內徑3 μm)；流動相：乙腈-50 mmol/L磷酸二氫鉀(含0.08%三乙胺)=15:85；流動相的流速為0.07 mL/min,分離電壓為0 KV，紫外檢測波長為210 nm。進樣量 2 μL；電壓施加在毛細管的出口端，進口端接地。

2 結果與討論

2.1 流動相的優化

本實驗對流動相的體積分數進行了優化，有機相乙腈的比例的改變，會改變樣品在固定相和流動相之間的分配比例，從而改變分離度[5]。 本實驗考察了乙腈的體積分數為10%，15%，20%時的分離效果。當乙腈體積分數為10%時不出峰，隨著乙腈體積分數的增加到20%，氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿不能完全達到基線分離。當乙腈體積分數選擇15%時，出峰良好，基本達到基線分離，因此本實驗選擇15%乙腈為有機流動相。本實驗同時考察了三乙胺對氫溴酸樟柳堿的分離影響。實驗發現，三乙胺的加入可明顯改善峰形，提高靈敏度，因此實驗選擇加入0.08%的三乙胺。

2.2 流動相流速的選擇

流速的大小直接改變柱壓，從而影響出峰時間以及分離度，本實驗考察了(0.05，0.07 mL/min)兩種流速對氫溴酸樟柳堿三種生物堿的分離效果。實驗表明在壓力允許的范圍內，流速的增大，可減小分離時間，縮短單個組分的出峰時間。因此本實驗選擇0.07 mL/min。圖1，圖2分別為流速0.05，0.07 mL/min，進樣量2 μL混標的分離情況，峰1，2，3，分別為氫溴酸樟柳堿、氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿。

圖1 混標電色譜圖(流速0.05 mL/min，進樣量2 μL)

圖2 混標電色譜圖(流速0.07，進樣量2 μL)

2.3 分離電壓的選擇

電壓的增加會改變電滲流的大小，從而影響各組分之間的保留情況。本實驗考察了不同電壓(+6，+15，0，-6，-15 kV)下對氫溴酸樟柳堿等三種生物堿的分離效果。由圖3～圖6可知，在毛細管出口端施加正電壓或負電壓，都對氫溴酸樟柳堿、氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿三種生物堿的出峰時間無顯著影響，也無改善峰形等影響效果。并且隨著電壓的增大，電流持續時間增長，會出現焦耳熱，從而增加基線的平衡時間。對比不加電壓的情況，綜合選擇0 kV為分離電壓。

圖3 混標電色譜圖(流速0.07，進樣量2 μL，+6 kV)

圖4 混標電色譜圖(流速0.07，進樣量2 μL，+15 kV)

圖5 混標電色譜圖(流速0.07，進樣量2 μL，-6 kV)

圖6 混標電色譜圖(流速0.07，進樣量2 μL，-15 kV)

3 結 論

本文建立了加壓毛細管電色譜分離氫溴酸樟柳堿等三種生物堿類成分，在10 min內實現了氫溴酸樟柳堿、氫溴酸山莨菪堿、氫溴酸東莨菪堿三種生物堿快速高效分離，該方法的分離時間短，消耗有機試劑量小，為氫溴酸樟柳堿等生物堿類成分的分離提供了一種新型快速高效的分離方法。