E6/E7 mRNA檢測篩查妊娠期高危型人乳頭瘤病毒感染的價值研究

楊詠梅，王鳳英*，廖秦平，肖群，康寧，吳潔

宮頸癌的發生與高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）的持續感染密切相關［1］。病毒與宿主DNA整合實現逆轉錄被認為是宮頸病變惡性進展的一個重要標志［2-3］。針對HR-HPV DNA的檢測方法靈敏度高，但特異度低，陽性檢測結果無法準確判斷是否伴有宮頸組織學高級別病變，反而易造成過度治療導致醫療資源浪費［4］。妊娠期宮頸病變的診治要同時考慮對孕婦和胎兒的影響，因此更應審慎。但HR-HPV感染，如不能明確有無宮頸病變，一方面易給孕婦造成不必要的精神負擔，另一方面也易造成宮頸癌的漏診。在非妊娠期女性中，應用E6/E7 mRNA檢測宮頸癌較DNA檢測具有同樣的臨床靈敏度及陰性預測值，同時特異度較高，可降低陽性預測值的假陽性率［5-6］。但是E6/E7 mRNA檢測是否可以用于妊娠期HPV感染的診斷與管理，尚無有效的試驗支持。本研究將妊娠期HR-HPV感染E6/E7 mRNA載量檢測與HR-HPV DNA檢測進行對照比較，以宮頸活檢病理結果為金標準，探討將E6/E7 mRNA檢測應用于妊娠期HR-HPV感染及宮頸病變診斷與分流管理，提高診斷效能，從而減少妊娠期非必要的有創檢查。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年1月在首都醫科大學宣武醫院婦產科建檔定期產檢的20～45歲育齡妊娠期女性為研究對象，均為單胎妊娠，既往體健，無內外科合并癥及免疫抑制性疾病，未服用任何免疫抑制性藥物，均簽署知情同意書。

納入標準：（1）2次以上薄層液基細胞學檢查（TCT）結果為不典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）伴HR-HPV DNA檢測陽性；（2）TCT結果顯示病變程度在ASCUS以上伴/不伴HR-HPV DNA檢測陽性；（3）HR-HPV DNA檢測結果為HPV 16、18亞型。

排除標準：拒絕簽署知情同意書；拒絕行陰道鏡檢查及宮頸活檢。

1.2 樣本采集與處理 研究對象進行TCT及HR-HPV DNA檢測，結果異常者進一步行陰道鏡檢查并取活組織送病理檢查，同時留取宮頸脫落細胞，檢測HR-HPV E6/E7 mRNA 片段。

1.2.1 TCT樣本的采集與處理 研究對象取膀胱截石位，圍繞宮頸順時針方向旋轉5～7周，采集宮頸外口及宮頸管的脫落細胞。病理科制片后由2名細胞病理專家在不知道HR-HPV DNA檢測結果的情況下閱片進行診斷，按2001國際癌癥協會（NCI）推薦的The Bethesda System（TBS）方式進行報告。如診斷存疑，請第3位上級專家協助，共同做出診斷。本研究將2次檢測為ASCUS、ASCUS以上和各級腺細胞異常記為TCT結果異常。

1.2.2 HR-HPV DNA樣本采集方法及處理 應用快速導流雜交基因芯片技術結合低密度基因芯片技術（HPV GenoArray Test kit，Hybribio Ltd. Hong Kong）對標本進行HR-HPV DNA分型檢測，鑒別21種HPV基因亞型，包括15種高危型亞型：HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68 以 及 6 種低危型（6、11、42、43、44和 CP8304）。

1.2.3 陰道鏡樣本采集與處理 對于TCT結果異?；騂R-HPV DNA檢測結果陽性的妊娠期研究對象，如存在以下情況：液基細胞學TBS報告中提示2次結果為ASCUS伴HR-HPV DNA檢測陽性；或病理結果顯示病變程度在ASCUS以上伴或不伴HR-HPV DNA檢測陽性；或HPV 16、18亞型感染，采用德國LEISEGANG公司的光學電子數碼陰道鏡，由2名經過專業培訓經驗豐富的婦科醫師進行操作及檢查。病理結果解讀：在不知道HR-HPV DNA檢測結果及TCT結果的情況下，由2名病理學專家共同閱片確定最后病理結果。病理檢查結果分為正?；蜓装Y、宮頸上皮內瘤變（CIN）Ⅰ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸浸潤癌。將CINⅠ級及正?；蜓装Y定義為宮頸低級別病變及正常，將CINⅡ級、CINⅢ級定義為宮頸高級別病變。

1.2.4 HR-HPV E6/E7 mRNA 樣本采集方法及處理留取行陰道鏡檢查的妊娠期女性宮頸脫落細胞，檢測HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種高危亞型的HR-HPV E6/E7 mRNA片段。本研究以HR-HPV E6/E7 mRNA 拷貝數≥1 copy/ml為陽性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行數據整理與統計學分析。計數資料以相對數表示，比較采用Pearson χ2檢驗、McNemar配對χ2檢驗。靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值采用傳統列聯表計算。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人口學特征 本研究共調查20～45歲健康單胎妊娠女性1 058名，其中孕早期322名、孕中期374名、孕晚期362名，平均年齡（29.8±3.3）歲。1 058名妊娠期女性中，TCT結果異常和/或HPV 16、18亞型者118名，同意行陰道鏡檢測并成功獲得病理檢查結果者84名。病理檢查結果顯示正?；蜓装Y21例、CINⅠ級34例、CINⅡ級18例、CINⅢ級11例。

2.2 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測與病理檢查結果比較 在病理檢查結果為CINⅠ級及正?；蜓装Y的女性中，HR-HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率均低于HR-HPV DNA檢測陽性率，差異有統計學意義（P＜0.05）；在病理檢查結果為CINⅡ級及CINⅢ級的女性中，HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 84名行病理檢查的妊娠期女性HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of HR-HPV DNA testing，HR-HPV E6/E7 mRNA detection and pathological examination results in 84 pregnant women

2.3 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測預測宮頸高級別病變的效能 McNemar配對χ2檢驗結果顯示：HR-HPV E6/E7 mRNA檢測預測宮頸高級別病變的靈敏度低于HR-HPV DNA檢測，特異度高于HR-HPV DNA檢測，差異有統計學意義（P＜0.05）；Pearsonχ2檢驗結果顯示：HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測預測宮頸高級別病變的陽性預測值、陰性預測值比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2～3。

表2 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測預測宮頸低級別病變及正常、高級別病變情況〔n（%）〕Table 2 Comparison of HR-HPV DNA testing，and HR-HPV E6/E7 mRNA detection in predicting low- and high-grade cervical lesions

表3 HR-HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢測預測宮頸高級別病變的效能Table 3 Comparison of diagnostic efficacy of HR-HPV DNA testing and HR-HPV E6/E7 mRNA detection for high-grade cervical lesions

3 討論

2019 年美國陰道鏡和宮頸病理學會（ASCCP）宮頸癌篩查結果異常和癌前病變的管理共識提出基于HPV篩查、結合患者風險評估的精確管理模式，使診斷、治療和隨訪的建議更加個性化［7］。

關于妊娠期合并CIN的發生率國內外報道并不一致（0.08%～5.00%）［8-9］。吳霞等［10］報道北京地區妊娠期宮頸上皮細胞異常發生率為3.95%，與非妊娠期3.22%的發生率相近。妊娠期由于宮頸柱狀上皮異位，局部組織被柱狀上皮覆蓋，組織菲薄，毛細血管豐富，在陰道鏡檢查中易引起出血，嚴重狀態下需宮頸局部縫扎止血，增加宮頸損傷。此外妊娠期女性常對陰道操作存在抵觸情緒，不愿進行檢查，造成宮頸病變尤其是惡性宮頸病變的漏診，最終影響母嬰安全。最新研究提示，妊娠期HPV感染可經由母體通過陰道傳播至子代，造成子代罹患肺癌的風險增加［11］。但由于目前HR-HPV DNA檢測的特異度尚不能令人滿意，單純HPV檢測結果陽性反而給妊娠期女性造成一定的心理和經濟負擔，誘發圍生期孕婦精神狀態異常，間接影響妊娠期母嬰安全?；谌焉锲趯m頸病變的特點，診療過程中既要避免過度診療，同時亦不能遺漏宮頸浸潤癌的診斷。因而目前迫切需要一種具有良好的診斷效能，既能有效地診斷出宮頸高級別病變，又能使漏診率降到最低的檢測手段。

國外很多學者對HR-HPV檢測陽性人群的分流方法進行了大量相關試驗，其中包括宮頸TCT、分型檢測HPV 16、18亞型，分型檢測HPV 16、18、31、33、45亞型高危病毒以及進行p16或Ki67免疫組化等多種方法［12］。

機體宮頸組織發生HR-HPV持續感染后，在一定條件下，通過E6/E7癌基因轉錄形成E6/E7 mRNA，最后翻譯成E6/E7癌蛋白，作用于宿主細胞，最終發揮致癌作用。由此可見，E6/E7 mRNA的轉錄表達是宮頸惡性病變發生、發展的必由之路，也是HPV病毒致癌活性的一個標志，因而可以通過對其復制轉錄檢測，達到預測病變進展風險的目的。

國外研究顯示，非妊娠期HR-HPV DNA檢測對診斷CINⅡ級及以上病變的靈敏度優于HR-HPV E6/E7 mRNA檢測，為70%～100%，而HR-HPV E6/E7 mRNA檢測的靈敏度一般在60%～90%，但HR-HPV E6/E7 mRNA檢測在特異度上要高于HR-HPV DNA檢測［13-14］，尤其對于預測宮頸病變進展方面優于HR-HPV DNA檢測［15-16］，因而考慮可將其應用于HR-HPV檢測陽性人群的分流。但目前將HR-HPV E6/E7 mRNA檢測應用于妊娠期宮頸病變診斷的研究相對較少。故而本研究將其應用于妊娠期宮頸高級別病變的診斷，以期為妊娠期宮頸病變，尤其HPV陽性人群的診斷分流提供相關思路。

由于CINⅡ級及以上病變進展為宮頸浸潤癌的發生率極大增加，因而本研究將宮頸高級別病變作為重點觀察指標，評價HR-HPV E6/E7 mRNA檢測對于CINⅡ級及以上宮頸病變的診斷效能。在CINⅠ級及正?；蜓装Y結果中，HR-HPV E6/E7 mRNA檢測的陽性率低于HR-HPV DNA檢測，而在CINⅡ級及CINⅢ級檢測結果中，兩者陽性率無統計學差異；考慮造成HR-HPV E6/E7 mRNA 檢測在早期宮頸病變中陽性率低的原因為病毒處于相對靜默期，由于絕大部分CINⅠ級可自行消退，因而很可能僅停留在HPV感染整合期，而未進展到 E6/E7癌基因大量轉錄復制的地步，因而其陽性檢測率較低。將HR-HPV E6/E7 mRNA 檢測對宮頸高級別病變的檢測靈敏度與特異度和HR-HPV DNA檢測比較，發現HR-HPV E6/E7 mRNA 檢測的特異度較高，而靈敏度較低。

綜上所述，HR-HPV E6/E7 mRNA檢測可以在一定程度上提高CINⅡ級及以上宮頸高級別病變的診斷特異度，但存在靈敏度稍低的可能。因而考慮是否將HR-HPV E6/E7 mRNA檢測應用在TCT結果為正?；駻SCUS及低度鱗狀上皮內病變（LSIL），而HR-HPV DNA檢測陽性（尤其HPV 16、18亞型）結果的基礎之上，作為風險評估的一部分，進行陰道鏡檢查的分流指導，避免妊娠期非必要有創檢查，做到更為精準的個體化診療。

作者貢獻：王鳳英、廖秦平負責文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析；楊詠梅、肖群、康寧、吳潔負責數據收集；楊詠梅負責數據整理、統計學處理、結果分析與解釋、撰寫論文；楊詠梅、王鳳英負責論文修訂；王鳳英對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

本研究局限性：

妊娠期是女性極為特殊的生理時期，此時期的相關檢查尤其有創檢查需考慮母嬰兩方面，盡量保證雙方安全最大化，因而所采取的診斷方法需慎之又慎。因客觀條件所限，本研究薄層液基細胞學檢查（TCT）結果異常和/或高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）檢測結果陽性標本例數較少，故而所得結論尚需進一步隨機大樣本試驗支持，同時研究時限較短，未能監測陽性病例遠期宮頸惡性腫瘤發生情況及子代HR-HPV相關性疾病發生情況。未來研究需擴大樣本量，以論證本研究所得結果。